Smac类似物Birinapant的抗肝癌作用及相关分子机制*

蒋盼若 , 柯瑞君 , 朱明了， 楼恩哲 , 谢佳庚 , 陈佳玉

(绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000)

肝癌是全球癌症患者死亡的主要原因之一。2015年高达810 000名患者死于肝癌。全球2015年有854 000例肝癌新增病例，其发病率较1990年增加了75 %[1]。大多数肝癌患者确诊时均已为癌症的中晚期，危害性大，而目前的治疗手段尚无法实现对其真正意义上的治疗[2, 3]。因此，发现有效治疗肝癌的药物或疗法迫在眉睫。

Smac(Second mitochondria-derived activator of caspases)是存在于线粒体中的促进细胞凋亡的重要蛋白，其低表达常常导致肿瘤等疾病的发生。Birinapant为Smac的类似物，有资料证实，该药物具有抗慢性乙型肝炎[4]、急性髓细胞白血病、黑色素瘤、乳腺癌等的作用[5-7]。但Birinapant对肝癌的作用及相关机制尚未见报道。本研究探讨Birinapant对肝癌细胞QGY-7701的作用，并分析其作用的分子机制，以期为肝癌治疗新药的发现提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌QGY-7701细胞株源自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由绍兴文理学院医学院实验室长期保存。细胞在37℃、5% CO2条件下，用含有10 % 胎牛血清的RPMI-1640培养液培养传代。

1.2 实验动物

BALB/C小鼠，雄性，4周龄，购于浙江省实验动物中心。

1.3 主要试剂

Birinapant为美国Med Chem Express公司产品；一抗和酶标二抗购自于武汉BOSTER Biotech公司；PCR引物由上海Sangon Biotech公司合成；AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒和脱脂奶粉源自美国BD公司；JC-1由碧云天生产；Cell titer 96® AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay(MTS)试剂盒购自于美国Promega公司；LDH试剂盒为上海Roche Applied Science公司产品；RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清、胰酶均源于美国的Gibco公司。TRIzol、SuperScript® III First-Strand Synthesis System为美国Invitrogen公司产品。ECL化学发光液购自美国SIGMA公司；Hoechst 33342、BCA蛋白浓度测定试剂盒和RIPA裂解液(强)由上海Beyotime公司提供。

1.4 MTS法检测细胞增殖活性

取处于对数生长期的QGY-7701细胞，经胰酶消化、PH 7.4的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤3次后，600 g离心5 min，回收细胞，用RPMI-1640完全培养液调整细胞密度至5×104cells /ml，将细胞悬液接种96孔细胞培养板，100 μl /well，于37℃ 5% CO2条件下培养。Birinapant经DMSO溶解后，经RPMI-1640完全培养液配制成含Birinapant 0、1、5、25和125 nmol/L的溶液，并补齐DMSO。待细胞贴壁后，弃上清，分别加入上述溶液。设3复孔和空白对照孔。将细胞于37℃ 5% CO2条件下分别培养0、24、48和72 h后，每孔加入20 μl MTS([3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt])，于37℃ 5% CO2条件下继续孵育3 h后，利用全自动酶标仪(美国伯乐，iMark)于490 nm波长检测吸光度(OD值)，绘制细胞的生长曲线。

1.5 流式细胞仪分析细胞凋亡水平

胰酶消化经Birinapant(终浓度0、1、5、25、125 nmol/L)作用24 h后的QGY-7701细胞，PBS洗涤3次，于4℃、600 g条件下离心5 min，回收细胞。用冰预冷的PBS将细胞浓度调整至1×106cells/ml。取细胞悬液1 ml，600 g离心5 min后弃上清，细胞沉淀经100 μl 1×结合缓冲液重悬。分别加入5 μl异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白-V(Annexin V-FITC)和5 μl的Propidium Iodide(PI)染液，充分混匀，避光、室温孵育15 min，用流式细胞仪(BD公司，美国)检测细胞的凋亡率。

1.6 Hoechst 染色观察细胞核型变化

取浓度5×105cells/ml的处于对数生长期的QGY-7701细胞，接种于6孔细胞培养板，1 ml/well，设3复孔。待细胞贴壁后，加入终浓度分别为0、25和125 nmol/L的Birinapant，37℃ 5% CO2条件下孵育24 h，用PBS洗涤细胞3次，加入10 ng /ml的hoechst 33342染色剂1 ml，37℃避光孵育15 min。PBS洗去未与细胞结合的染料，荧光倒置显微镜(尼康，日本)下观察细胞的核型并拍照。

1.7 JC-1染色检测细胞线粒体膜电位

5×105cells/ml的肝癌细胞QGY-7701接种于6孔细胞培养板，2 ml /well，37℃ 5% CO2条件下培养至细胞贴壁，于上清中加入Birinapant，使其终浓度分别为0和25 nmol/L，设3复孔，于37℃、5% CO2条件下培养24 h。JC-1染色试剂用量和具体操作按照说明书进行。染色完成后，胰酶消化细胞，PBS清洗3次后，流式细胞仪(BD公司，美国)分析细胞线粒体膜电位。

1.8 Real time PCR分析基因的转录水平

胰酶消化处于对数生长期的QGY-7701细胞，PBS清洗3次后，调整其细胞浓度至5×105cells/ml，接种于6孔细胞培养板，1 ml /well，设3复孔。待细胞贴壁后，加入终浓度分别为0和25 nmol/L的Birinapant，于37℃ 5% CO2条件下继续培养24 h。弃上清，PBS清洗3次，按照试剂说明用Trizol提取细胞中的RNA，经Nano Drop定量后，用SuperScript® III First-Strand Synthesis System逆转录成cDNA，试剂用量和具体操作按照说明书进行。以β-actin为内参，Real time PCR检测各基因 mRNA的CT值，采用2-△△CT法分析Birinapant作用后QGY-7701细胞基因转录水平的变化。

1.9 Western blot 检测细胞内蛋白表达水平的改变

将5×105cells/ml的肝癌细胞QGY-7701接种于6孔细胞板中，1 ml/well，设3复孔，37℃ 5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，将培养液换为含有终浓度为0、5、25和125 nmol/L Birinapant的RPMI-1640完全培养液，继续培养24 h(设3复孔)。弃上清，PBS清洗3次，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，回收裂解产物，12 000 r/min离心20 min。取上清1 μl，BCA法进行蛋白定量后，以β-actin为内参进行蛋白电泳，上样量30 μg /well。电泳结束后，蛋白经湿转、封闭和一抗、酶标二抗孵育后，电化学发光液(ECL)进行显色，利用Image Quant LAS 4000 mini超灵敏化学发光成像仪自动曝光成像。

1.10 抑瘤实验

取4周龄雄性BALB/C小鼠，随机分5组(0、1、5、25和125 μg/kg Birinapant用药组)，每组20只，无菌条件下饲养一周，待其适应环境后，取对数生长期的肝癌细胞QGY-7701，胰酶消化后，600 g离心5 min，去上清，PBS清洗2次，600 g 离心5 min，完全弃上清，用注射用生理盐水调整细胞浓度至1×107wells/ml，用生理盐水稀释成0.5 ml，腹股沟注射BALB/C小鼠，100 μl /只。两天后对应的各组皮下分别注射Birinapant(0、1、5、25和125 μg/kg)，每隔一天注射一次，首次注射Birinapant的第18日，每组脱颈处死10只小鼠，取瘤组织称重，并记录各组剩余10只小鼠的存活期。

1.11 LDH释放实验检测药物细胞毒作用

将肝癌细胞QGY-7701接种于96孔细胞板中(细胞浓度5×104cells/ml)，100 μl /well。37℃ 5% CO2条件下培养。待细胞贴壁后加入Birinapant，使药物的终浓度分别为0、1、5、25和125 nmol/L，37℃、5% CO2条件下继续培养24 h，按照LDH检测试剂盒说明检测培养液和细胞裂解液中的LDH，并根据公式LDH释放率(%)=培养液中LDH含量 /(培养液中LDH含量+细胞裂解液中LDH含量)×100%计算药物作用后细胞的LDH释放率。

1.12 统计学处理

2 结果

2.1 Birinapant对 QGY-7701细胞增殖活性的影响

结果如图1，Birinapant对肝癌细胞QGY-7701的增殖活性有显著抑制作用(P<0.01)，且其抑制效果与该药的作用时间和剂量成正相关。

Fig.1The proliferation activity results of QGY-7701 cells (n=3)

2.2 Birinapant对QGY-7701细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果证实，25、125 nmol/L的Birinapant分别作用于QGY-7701细胞24 h后，早期凋亡的细胞(Q3)和晚期凋亡的细胞(Q2)比例均明显增加，即25 nmol/L和125 nmol/L的Birinapant可显著诱导该细胞的凋亡(P<0.01)，其作用与用药剂量呈正相关(图2，表1)。

Fig.2The apoptosis results detected by flow cytometry (n=3)

Tab.1The proportion of cells in various states (%,n=3)

BirinapantDead cellsLate apoptosis cellsEarly apoptosis cellsNormal cells0 nmol/L1.23±0.091.86±0.133.42±0.1193.57±0.7125 nmol/L3.08±0.165.15±0.1923.45±0.2868.25±0.44125 nmol/L3.75±0.12∗∗23.27±0.25∗∗61.35±1.04∗∗11.44±0.06∗∗

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.3 Birinapant对QGY-7701细胞核型的影响

Hoechst 33342 染色结果如图3所示，肝癌细胞QGY-7701经25 nmol/L或125 nmol/L Birinapant作用24 h后，细胞核内染色质浓集，核固缩，荧光强度增强，核碎裂，有凋亡小体形成，且细胞核型的改变与药物作用剂量相关。

Fig.3The results of hoechst 33342 staining(n=3)

2.4 Birinapant对QGY-7701细胞线粒体膜电位的影响

25 nmol/L的Birinapant对肝癌细胞QGY-7701进行处理，JC-1染色后，胰酶消化，PBS清洗3次后流式细胞仪检测，结果如图4和表2所示，25 nmol/L药物作用组肝癌细胞的线粒体膜电位显著降低(P<0.01)。

Fig.4JC - 1 staining results of cell mitochondrial membrane potential(n=3)

BirinapantUndown-regulated cellsDown-regulated cells0 nmol/L99.84±0.530.01±0.0125 nmol/L50.33±0.2749.62±0.18∗∗

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.5 Birinapant对QGY-7701细胞某些基因转录的影响

提取经0、25 nmol/L Birinapant作用24 h后的肝癌细胞QGY-7701的mRNA, real time PCR检测结果显示(表3)，Birinapant显著抑制ras、raf、mek、erk、cIAP-1和cIAP-2基因的转录水平，而基因caspase-9和caspase-3的转录水平却明显上调(P<0.01)。

2.6 Birinapant对QGY-7701细胞某些蛋白表达的影响

0、5、25或125 nmol/L的Birinapant作用QGY-7701细胞 24 h后，Western blot检测结果显示(图5和表4)，cIAP-1、cIAP-2、Ras、p-MEK、p-Raf和p-ERK蛋白表达明显受抑，而Caspase-3和Caspase-9的表达显著增加。

Fig.5The western blot results of the proteins

Tab.3 The real time PCR results n=3)

cIAP-1: Cellular inhibitor of apoptosis protein 1; cIAP-2: Cellular inhibitor of apoptosis protein-2

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

Tab.4 The integrated density of protein bands n=3)

*P<0.05，**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.7 Birinapant对QGY-7701细胞LDH释放率的影响

如表5所示，Birinapantr对QGY-7701有显著的细胞毒作用，且其作用效果和药物作用的剂量相关，差异有显著意义(P<0.01)。

Tab.5 The results of LDH release experiment n=3)

**P<0.01vs0 nmol/L Birinapant treated group

2.8 Birinapant对荷瘤小鼠肝癌生长及生存期的影响

结果如表6，Birinapant有显著的抑瘤作用(P<0.01)，且其作用效果与药物作用的浓度相关。此外，结果亦证实，在1～25 μg /kg药物作用浓度的范围内，荷瘤小鼠的生存期明显延长(P<0.01)，当用药剂量达到125 μg /kg时，小鼠生存期缩短。

Tab.6 The tumor suppression test results n=10)

**P<0.01vs0 μg/kg Birinapant treated group

3 讨论

本研究显示，Birinapant抑制肝癌细胞QGY-7701中cIAP-1和cIAP-2的表达，并激发Caspase-9 -Caspase-3级联反应，进而有效地抑制QGY-7701细胞的增殖活性，并诱导其凋亡，从而延缓荷瘤小鼠瘤组织的生长，延长其生存期，发挥了抗肝癌的作用。

细胞凋亡为细胞的程序性死亡，它对维持机体的正常发育和内稳态起着至关重要的作用，当细胞凋亡水平发生变化时，肿瘤等疾病就会发生[8]。细胞凋亡受细胞内一系列蛋白的调控，其中凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)与癌症的发生发展关系尤为紧密，cIAP-1和cIAP-2是IAP家族主要成员，它们均可以通过抑制Caspase表达而发挥抑制凋亡的作用[9]，Caspase 家族是细胞凋亡过程中起着调节和执行作用的重要枢纽，Caspase的异常变化提示细胞凋亡水平的改变。线粒体凋亡途径是人体中基本的凋亡方式，Caspase家族主要也是在该途径中发挥作用，触发线粒体介导的内源性凋亡途径来诱导肿瘤细胞凋亡成为治疗癌症的潜在方法[10]。Smac是存在于线粒体中IAP的天然抑制剂，它可与IAP结合，使其发生自动泛素化，并在蛋白酶介导下降解，从而导致Caspase的失抑制，促进肿瘤细胞的凋亡[11]。Birinapant为二价的Smac类似物，有资料证实，它可上调结肠癌细胞HCT 116和乳腺癌细胞MDA-MB -231中caspase-3的表达，从而促进该肿瘤细胞的凋亡[12, 13]，而本研究也证实了此点。

此外，本研究亦显示，Birinapant可抑制MEK/ERK信号通路主要蛋白Ras、Raf、MEK和ERK的表达。RAF/MEK/ERK 的级联反应需要Ras GTPase 的磷酸化激活，而最终被激活的ERK能够磷酸化或与大量(>300)胞质和核底物相互作用，这些底物将信号传播给负责特定启动过程的特定目标，这在疾病的发生发展中有重要意义[14, 15]。MEK/ERK信号通路参与细胞分化、凋亡、增殖、细胞周期等多方面的生物调节，资料显示，30%的人类癌症的发生发展与该通路的活化有关，Raf和MEK更是在多发性骨髓瘤、前列腺癌、肝癌等肿瘤中显著表达[16-18]，因此Birinapant对肝癌细胞QGY-7701增殖活性的抑制作用和对其凋亡的诱导作用，与其抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号通路蛋白的表达密切相关。

综上，Birinapant可通过下调cIAP-1、cIAP-2和Ras - Raf - MEK - ERK信号通路相关蛋白的表达，激活线粒体介导的内源性凋亡通路，从而抑制肝癌细胞的增殖，诱导其凋亡，对肝癌有一定的抑制作用。该实验为进一步深入研究Birinapant在肝癌治疗中的临床应用提供了依据。