黄芩素对人口腔鳞癌细胞增殖和侵袭的作用及其机制*

王根桃， 黄 松

(1.福建省肿瘤医院口腔科, 福州 350014； 2.华中科技大学同济医学院附属梨园医院骨外科, 湖北 武汉 430077)

口腔癌是临床常见的恶性肿瘤之一，全球每年新增口腔癌患者约10万人[1]。但是绝大多数口腔癌为口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，恶性程度较高，治疗主要以手术为主，放化疗相结合为辅[2]。近年来，靶向药物已成为研究的热点，它不仅能够抑制多种肿瘤的发生发展，而且药物的副作用也有一定程度的降低。例如易瑞沙已应用于肺癌的治疗并取得良好的治疗效果。因此，对口腔鳞癌进行深入研究，寻找更多潜在的靶点是十分必要的[3-4]。近年来研究表明，ERK-FAK信号传导通路参与细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等多种生物学反应, 此通路的异常可能是肿瘤发生的机制之一[5]。

黄芩素(baicalein, BAI)来源于中药黄芩，具有多重药理作用，例如抗炎、抗感染、抗肿瘤细胞增殖等作用。因其作用广泛且具有高效低度的特点，所以我们检测了黄芩素是否可以抑制口腔鳞癌细胞的增殖和侵袭。因此, 我们用不同浓度的黄芩素来处理口腔鳞癌细胞，用Western blot、PCR等方法检测E-cadherin, Vimentin, 细胞外信号调节激酶(extracellular singnal-regulated kinase, ERK)和粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的变化。实验结果表明，黄芩素可能通过ERK-FAK信号通路抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭，为黄芩素更好地应用于临床提供实验基础。但是其具体的分子机制还尚待研究。

1 材料与方法

1.1 试剂

人口腔鳞癌细胞株TCA8113购自 American Type Culture Collection( ATCC)。实验所用抗体购自 Santa Cruz Biotechnology公司。黄芩素购自南京广润生物制品有限公司。MEK抑制剂购自selleck公司。DMEM、胎牛血清、TRIzol、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。CCK8试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2 实验分组、细胞培养及检测指标

本研究分为两个实验，每个实验4个组，每组重复3此。实验1：黄芩素用DMSO溶解，配成浓度为100 mmol/L的储存液备用并稀释成4个浓度：control, 20 μmol/L BAI, 40 μmol/L BAI, 80 μmol/L BAI；实验2： MEK抑制剂(U0126)用培养基溶解，其IC50等于0.33 nmol/L，实验处理因素为：control, 40 μmol/L BAI, MEK抑制剂，MEK抑制剂+40 μmol/L BAI。各组分别处理24 h和48 h。与80 μmol/L BAI处理组相比，对照组、MEK抑制剂处理组以及其他低浓度的BAI处理组用DMSO配平，保证各组DMSO浓度一致。用含有10% 的胎牛血清(100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)培养, 孵箱条件为37℃、 5% CO2。检测指标有细胞增殖情况，Vimentin和E-cadherin的mRNA以及蛋白水平，ERK, p-ERK, FAK, p-FAK的蛋白水平。

1.3 CCK8实验检测细胞增殖率

在96孔板中配置100 ml的细胞悬液(约5×103cells/well)。将培养板在培养箱预培养8 h至贴壁。向培养板加入不同浓度的黄芩素。作用24和48 h后，向每孔加入10 ml CCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育2 h。用酶标仪在450 nm处测定吸光度。每组实验重复3次。

1.4 RNA提取及半定量PCR检测mRNA水平

将细胞铺于6孔板中(约5×104cells/well)，待细胞6～8 h贴壁后，加入不同浓度的黄芩素。24和48 h后，用TRIzol法提取，最后再逆转录为cDNA。引物顺序: E-cadherin 上游：5’-ATTCGTATT- CTGCTGCTCTTG-3’, 下游：5’-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3’；Vimentin 上游：5’-CAGCCATGACCACCAGG-3’, 下游 5’-AAGGTCAAGACTGTCCAG-3； GAPDH 上游：5’-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3’, 下游：5’-AGGGGAGAATTCAGTGTGGTG-3’。每组实验重复3次。

1.5 Western blot实验检测蛋白水平

将细胞铺于6孔板中(约5 x 104cells/well)，待细胞6～8 h贴壁后，加入不同的处理因素(control, 20 μmol/Lol/L BAI, 40 μmol/Lol/L BAI, 80 μmol/L BAI或者control, 40 μmol/L BAI, MEK抑制剂，MEK抑制剂+40 μmol/L BAI)。分别在24与48 h用常规的蛋白裂解法提取。蛋白经过10% SDS-PAGE电泳，转膜以及抗体的孵育与洗涤。最后采用化学发光底物试剂盒(ECL)检测, 每组实验重复3次。蛋白条带采用Image J(V1.8.0)软件定量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 黄芩素对细胞增殖的影响

实验结果表示，与对照组相比，浓度梯度的黄芩素处理组的细胞增殖率逐渐降低，这说明黄芩素能够抑制肿瘤细胞的增殖，并且在48 h的作用明显高于24 h的作用(图1)。

2.2 黄芩素对细胞侵袭的影响

E-cadherin和Vimentin是肿瘤细胞发生迁移和侵袭的两个标志性蛋白。实验结果显示，与对照组相比，浓度梯度的黄芩素能够上调E-cadherin的水平，降低Vimentin的水平(图 2A，2B)。

Fig.1The cells’ survival rate under different concentrations of baicalin(BAI) treatment(n=3)

**P<0.01vs0 μmol/L BAI group

Fig.2The effects of BAI on the expressions of E-cadherin and Vimentin(n=3)

A: The mRNA level change of E-cadherin and Vimentin; B: The protein level change of E-cadherin; C: The protein level change of Vimentin

*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L BAI group

2.3 黄芩素对肿瘤细胞中ERK-FAK信号通路的影响

ERK-FAK信号通路异常与口腔鳞癌密切相关。因此，我们用Western blot检测药物处理之后的ERK, p-ERK, FAK以及p-FAK的表达。结果显示，黄芩素对总的ERK(图3A)与FAK(图3C)并没有明显的变化，但是可以明显降低磷酸化的ERK(图3B)与FAK(图3D)蛋白水平。

Fig.3The effects of BAI on the expressions of ERK， p-ERK， FAK and p-FAK(n=3)

A: ERK protein level; B: p-ERK protein level; C: FAK protein level; D: p-FAK protein level

*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L BAI group

2.4 MEK抑制剂对口腔鳞癌细胞的增殖迁移以及ERK-FAK信号通路的影响

Western blot分析结果显示MEK抑制剂(U0126)能够增强黄芩素的作用，上调E-cadherin(图4A)的表达，下调Vimentin(图4B)的表达，进一步抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。与对照组相比， 黄芩素处理组p-ERK(图4D)以及p-FAK(图4F)的蛋白表达水平升高，但总的ERK(图4C)以及FAK(图4E)的蛋白水平并没有明显的变化。这提示着黄芩素发挥其增殖侵袭抑制作用可能与ERK-FAK信号通路相关。

Fig.4The effects of MEK inhibitor and BAI on the expressions of E-cadherin, Vimentin, ERK, p-ERK, FAK and p-FAK (n=3)

A: The level change of E-cadherin； B: The level change of Vimentin； C: The level change of ERK； D: The level change of p-ERK； E: The level change of FAK； F: The level change of p-FAK

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 讨论

细胞增殖、凋亡调节失控是肿瘤发生、发展的主要因素之一[6]。由于肿瘤细胞具有侵袭转移的特性，使得临床上很难完全治愈各种肿瘤。对肿瘤患者进行手术前诱导化疗，由于局部血管破坏较少，血液供应良好，因此有利于化疗药物更好地进入肿瘤细胞。口腔鳞癌是一个日趋严重的世界范围内的问题；由于其治疗的局限性，口腔鳞癌患者的生存率仍无明显的改善。新辅助化疗PF方案，即DDP和5-Fu的联合应用，被认为是口腔鳞癌术前诱导化疗的首选方案。但临床上一些理学指标难以测定，使得我们较难客观评价其疗效[7]而且化疗药物带来的副作用大大降低患者的生活质量。因此，寻找新的治疗药物或新的治疗靶点迫在眉睫。

近年来，从天然药物中寻找有效的成分现已成为治疗肿瘤的热点。黄芩素主要存在于黄芩，是黄芩根中的主要有效成分[8]。黄芩素具有广泛的药理作用。它不仅能够改善脑血循环、增加脑血流量、降低脑血管阻力及抗血小板凝集，还能够发挥抗炎、抗 HIV、清除自由基和抗氧化、抗菌、保护神经元、抗过敏、抗糖尿病肾病等作用[9-11]。在临床上，黄芩素主要用于脑血管病后瘫痪的治疗。近年来研究发现，黄芩素还对肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞具有广泛的预防和治疗作用。黄芩素对A549细胞生长和增殖具有强大的抑制作用[12]。Miocinouic等的研究结果显示, 黄芩素通过降低细胞内活性氧(ROS)水平显著抑制前列腺癌DU-145瘤体的血管生成[13]。但是其具体的分子机制还不清楚。

信号通路异常是大多数肿瘤发生发展的一个重要的因素，常见的异常通路包括，BMP/Smad，TGF-β，PI3K/AKT，p53，mTOR等。研究表明，异常的ERK-FAK信号通路也涉及肿瘤发展的过程[5]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号传递途径起着极为重要的作用，控制着细胞多种生理过程。胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族的一员，具有多种生理作用，如调节细胞生长、发育、分裂、死亡、增殖、分化和存活等。在许多人类的癌症(如口腔癌、黑色素瘤 、乳腺癌等)中都可发现ERK的过度激活[14]。FAK为局部粘着斑激酶，是一种酪氨酸激酶，并且与ERK之间具有密切联系。据研究表明，ERK-FAK信号不仅参与平滑肌、神经元、糖尿病的调节[15-16]，它在肿瘤向恶性侵袭转移演进的过程中起着重要的作用[17]。王亚峰[18]等提出纤连蛋白可以通过激活FAK，从而促进口腔鳞癌细胞的增殖，但是并没有把传统中药与口腔鳞癌的治疗相结合。本研究采用Western blot等方法证实黄芩素可能通过ERK-FAK通路抑制口腔鳞癌细胞的增殖和侵袭。这些结果也为口腔鳞癌的治疗以及中成药的发展提供新的方案和基础。