儿童EB病毒感染肝功能损伤与Caspase-7水平的关系

胡玲珑，王菊香，周海霞，李原

（温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院，浙江 温州325000）

EB病毒是非嗜肝病毒感染引起儿童肝损害的常见病原体，原发性急性EB病毒感染可导致82%的患儿出现肝功能损伤[1]，大部分患儿的症状会在治疗1周内减退[2]。目前，对EB病毒感染导致肝功能损伤的机制尚未完全明确。Caspase-7是导致肝细胞凋亡的主要分子蛋白，但是否与原发性EB病毒感染导致的肝功能损伤存在相关性，目前尚未明确。本文探讨了原发性EB病毒感染肝功能损害与Caspase-7表达变化的相关性及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年1-12月在本院治疗的原发性EB病毒感染患儿236例，EBV-IgM检测均为阳性，其中肝功能正常74例为肝功能正常组，其中男 38例，女 36例，年龄（5.2±1.6）岁；伴肝功能损伤162例为肝功能异常组，其中男91例，女71例，年龄（4.8±1.5）岁。检测肝功能异常组急性期及恢复期的实验室指标，恢复期抽血时间为更昔洛韦针治疗第7天 （EB病毒感染更昔洛韦的常规住院治疗时间为 1 周）， 收集肝功能（AST、ALT、TBLL）数据，两组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经患者知情同意并经医院伦理委员会批准。

1.2 方法 ALT、AST采用全自动生化分析仪检测，TBLL检测试剂由浙江东欧诊断产品有限公司提供，ALT、AST和TBLL检测仪器均为德国西门子ADV2400。用ELISA法检测血清Caspase-7蛋白的表达水平，试剂盒为美国PeproTech公司生产，抗Caspase-7抗体购自英国abcom公司。取Caspase-7酶联免疫试剂盒，室温下静置30分钟，每孔加50μL标准样品或待测样品，留两孔为空白对照孔；塑料薄膜覆盖微孔板，孵育2小时；洗板4次，反转酶标板，拍干各孔剩余的洗涤液；每孔加50μL生物素标记的抗Caspase-7抗体，塑料膜封板，孵育2小时；洗板4次，反转酶标板，拍干各孔剩余的洗涤液；每孔依次加入显色剂A和显色剂B，避光室温孵育30分钟；加入反应终止液100μL，自动酶标仪于450nm处测定各孔的光密度 （optical density，OD）值，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品所测OD值确定其浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件对数据进行分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验，两组数据采用双变量相关性分析。

2 结果

2.1 肝功能和Caspase-7表达水平比较 肝功能异常组ALT和Caspase-7两指标在急性期和恢复期比较差异均具有统计学意义（均P＜0.01），肝功能异常组急性期ALT和Caspase-7的表达水平明显高于肝功能正常组，差异具有统计学意义 （均P＜0.01）。详见表 1。

表1 各组肝功能指标及Caspase-7表达情况（±s）

表1 各组肝功能指标及Caspase-7表达情况（±s）

与肝功能异常组急性期比较**P＜0.01，与肝功能正常组比较△△P＜0.01

组别 n A L T（U/L）A S T（U/L）T B L L（μ m o l/L）C a s p a s e-7（n g/m L）肝功能正常组 7 4 1 8.3±1.5 3 2.3±1.7 2 1.9±1.7 1 9 5.5±3 2.4肝功能异常组急性期 1 6 2 7 4.2±6.4△△ 3 1.7±1.9 2 2.4±1.9 9 3 2.2±8 6.5△△恢复期 1 6 2 3 3.4±2.3**3 2.1±2.5 2 2.6±2.1 4 7 8.5±4 9.2**

2.2 Caspase-7与ALT相关性分析 Caspase-7与ALT相关性分析肝功能异常组急性期Caspase-7表达水平与 ALT 呈高度正相关（r=0.965，P＜0.01）（图1），肝功能异常组恢复期Caspase-7表达水平与ALT 不存在正相关（r=0.109，P＞0.05）（图2）。

图1 肝功能异常组急性期ALT与Caspase-7的相关性

图2 肝功能异常组恢复期ALT与Caspase-7的相关性

3 讨论

EB病毒是临床上最常见的导致儿童肝损伤的非嗜肝病毒，属4型疱疹类病毒。肝功能损伤是原发性EB病毒感染最常见的并发症之一，但EB病毒感染如何导致肝损伤，其病理生理机制目前尚未完全明确。国内新的研究表明，EB病毒感染与乙肝病毒感染诱导的肝损伤存在相似性，可能与B淋巴细胞活动存在某种协同作用[3]；Zekri等[4]在临床研究丙肝时发现，如果EB病毒感染处于活动期，患者的转氨酶升高明显；2000年有研究揭示EB病毒感染可以激活机体免疫相关因子，进而导致各脏器损伤，主要表现为细胞的凋亡[5]，在诱导细胞凋亡的整个过程中细胞内Caspase系列蛋白酶的激活起着重要作用，提示Caspase系列蛋白可能参与了EB病毒感染致肝功能损伤的病理生理过程。

目前，已经明确的凋亡通道有三种，分别是Caspase-8参与传递的细胞外信号凋亡通路，Caspase-9参与介导的线粒体途径诱导的细胞凋亡，以及Caspase-12参与诱导的内质网应激细胞凋亡信号通路，在这三条Caspase参与介导的细胞凋亡信号通路中，最后都需经过Caspase-7产生效应[6]。众多文献也提示，肝炎肝细胞的损伤一般表现为凋亡的过程，并且和Caspase系列蛋白分子依赖的细胞凋亡过程紧密相关，其中Caspase-7的作用最显著。在乙肝、丙肝的临床实验中，大部分患者血清中Caspase-7的表达水平明显升高[7-8]，Masuoka等[9]在细胞实验中通过使用Caspase抑制剂来治疗丙肝，取得了显著的效果，但Caspase-7与原发性EB病毒感染诱导的肝功能损伤是否存在内在的相关性，目前尚未完全阐明。

既往在对丙肝的研究中发现，血清中Caspase-7分子表达的上升可直接导致肝细胞凋亡，继而出现肝功能损伤，在使用Caspase蛋白分子抑制剂后，Caspase-7蛋白分子表达水平明显下降，部分患者转氨酶也下降。本文发现原发性EB病毒感染后患儿血清中Caspase-7的分子水平上升明显，肝功能异常组急性期Caspase-7分子的表达水平也明显高于肝功能正常组，与既往研究一致；而急性期患儿血清中的Caspase-7表达水平以及ALT较恢复期患儿明显升高，说明EB病毒导致患儿肝功能受损，同时Caspase-7水平也升高。本文又对肝功能异常组急性期和恢复期的Caspase-7和ALT进行相关性分析，发现当患儿感染EB病毒后处于急性期，肝功能恶化时ALT升高，Caspase-7的表达水平也随之升高，急性期Caspase-7的表达水平与ALT呈正相关（r=0.965）；而当EB病毒感染患儿处于疾病恢复期时，ALT下降Caspase-7水平也随之下降，但下降不明显，两者之间不呈正相关。提示原发性EB病毒感染诱导的肝功能损伤与Caspase-7之间呈正相关，该相关关系以急性期最明显。

既往的研究认为，ALT才是提示肝功能急性损伤的最佳指标，早期AST和TBLL升高不明显，故本文出现肝功能异常组AST及TBLL指标急性期和恢复期无差异。