shRNA-survivin基因对绒癌细胞株JEG-3的增殖、迁移和凋亡的影响

张昱，袁祖国，万鹏

（宁波市鄞州人民医院，浙江 宁波 315040）

绒毛膜癌是一种高度恶性的肿瘤，继发于葡萄胎、流产或足月分娩后。少数可发生于异位妊娠后，多为育龄妇女，偶尔发生于未婚妇女的卵巢，称为“原发性绒毛膜癌”。绒毛膜癌约有50%来自于滋养层细胞的葡萄胎，25%来自正常妊娠，25%来自异常妊娠或者堕胎[1-2]。因此，寻求妊娠绒毛膜癌的新型分子治疗的靶点一直是研究的热点。生存素（survivin）是细胞抗凋亡基因家族中的最小成员，也是唯一抗凋亡蛋白。它可通过影响Caspase-9活性或抑制Caspase-3的下游细胞凋亡共同通路抑制凋亡[3]；本研究探讨survivin基因对绒癌JEG-3细胞增殖、迁移和凋亡的分子机制，从而为临床上绒毛膜癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清购自Gibco公司；DMEM及0.25%胰酶Trypsin购自美国Invitrogen公司；TRIZOL购自美国Invitrogen公司；氯仿、酒精（浓度为75%）及逆转录试剂盒购自美国ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR仪购自美国bio-rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绒毛膜癌细胞系JEG-3的培养 以人绒毛膜癌细胞系JEG-3为实验材料 （购自中科院上海细胞研究院），经离心收集后，以2×104/cm2的密度将其种植于25cm×25cm的培养瓶中。加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育，而后将细胞进行后续实验。

1.2.2 构建survivin基因的慢病毒沉默表达载体shRNA-survivin载体 survivin基因慢病毒干扰shRNA-survivin载体由上海吉凯公司合成，选择pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。过表达载体的克隆切入点是XhoI/BamHI，编号为ENST00000003569。经过基因测序，从而证明序列的正确性。

1.2.3 绒毛膜癌细胞的分组与干预措施 按照不同的处理方法将绒毛膜癌细胞分成3组，即空白对照组、空白载体慢病毒对照组和shRNA-survivin载体慢病毒组。空白对照组为未做任何处理的细胞组，空白载体慢病毒对照组是经空白载体的慢病毒转染的细胞组，shRNA-survivin载体慢病毒组是由shRNA-survivin载体构建的慢病毒转染细胞组。以ZsGreen为慢病毒荧光探针，用荧光显微镜观察细胞慢病毒的转染效率。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 三组细胞融合率达80%后，经0.25%胰蛋白酶消化放入15mL离心管，加入 1mL 的 Trizol RNA iso （Takara，日本），提取总RNA，根据Takara逆转录试剂盒的说明书检测总RNA的纯度，1.9～2.0为纯度良好。逆转录cDNA保存在4℃冰箱中备用。根据Takara荧光定量PCR试剂盒的说明书要求，采用20μL的反应体系，加入各样品进行荧光定量PCR检测。采用FS2000系统对PCR进行分析，反应条件预设为预变性：95℃ 30 秒；1 个循环。 PCR：95℃ 5 秒；60℃30秒，40个循环。溶解曲线：95℃ 5秒；60℃ 1分钟。降温：50℃30秒，1个循环。内参基因GAPDH、survivin、Caspase-3和Caspase-9引物由上海生工公司生产。采用2-△△CT的方法计算目的基因的相对表达量。详见表1。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Transwell小室实验检测细胞的迁移 三组细胞经胰蛋白酶消化后收集，按说明书要求将基底膜的基质原液放在冰箱冷藏（4℃）过夜融化，然后与预冷无血清的DMEM培养基按照1:3的比例配置侵袭上室凝胶液体，以每孔55μL的量包被Transwell小室的上室，放置于37℃的孵育箱，2小时后使上室成胶。再上室每孔接种200μL不含血清的细胞培养液，下室加入10%胎牛血清的DMEM培养液500μL，并将Transwell板放置在37℃的孵育箱中培养24小时后用结晶紫染色。最后将Transwell板用倒置光学显微镜拍照，并进行细胞计数。

1.2.6 CCK-8实验检测细胞的增殖 三组细胞经胰蛋白酶消化后收集，接种在96孔板中，以每孔5000个/100μL的接种量接种，按照CCK-8试剂盒说明书72小时后每孔加入10μL的CCK-8的试剂，放入37℃的孵育箱中培养2小时。使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度，每组设置3个复孔。

1.2.7 AV-PI试剂盒检测细胞的凋亡 三组细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照AV-PI试剂盒说明书检测细胞的凋亡率。流式细胞仪分析各组样本，计算各组凋亡率。Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+为晚期凋亡和坏死细胞，Annexin V-/PI+为正常细胞。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料用（±s）表示，多组间采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 shRNA-survivin载体的构建和转染 以绿色荧光蛋白（GFP）为荧光探针，完成survivin沉默表达的慢病毒载体的构建。慢病毒转染效率较高，以人绒毛膜癌细胞系JEG-3为实验对象，慢病毒转染率如图1所示。shRNA-survivin载体慢病毒转染滴度为 3×108TU/mL。

2.2 survivin、Caspase-3及 Caspase-9 mRNA 的表达 与空白对照组和空白载体慢病毒组比较，shRNA-survivin载体慢病毒组的survivin mRNA的相对表达量显著降低，而Caspase-3的mRNA、Caspase-9的mRNA显著升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。 详见表 2。

2.3 Transwell实验检测细胞的迁移 各组透过分子筛的细胞数分别为：空白对照组131.32±18.39，空白载体慢病毒对照组142.11±14.02，shRNA-survivin载体慢病毒组52.11±4.09。三组比较差异具有统计学意义（F=31.982，P＜0.05），其中 shRNA-survivin载体慢病毒组与空白对照组、空白载体慢病毒对照组比较，透过分子筛的细胞数显著降低，差异具有统计学意义（均P＜0.05），如图3所示。

图1 0.011μL慢病毒转染 JEG-3系效率要高于0.033μL慢病毒，表现为荧光亮度较强。

图2 三组survivin、Caspase-3及Caspase-9的表达

图3 三组透过分子筛的细胞数

图4 CCK-8检测细胞的增殖

2.4 CCK-8检测细胞的增殖 各组细胞的增殖率分别为：空白对照组（60.34±1.24）%、空白载体慢病毒对照组 （51.12±2.47）%、shRNA-survivin 载体慢病毒组（24.27±3.11）%。三组细胞的增殖率差异具有统计学意义（F=23.983，P＜0.05），其中，shRNASurvivin载体慢病毒组与空白对照组、空白载体慢病毒对照组比较细胞增殖率显著降低，差异具有统计学意义（均P＜0.05），如图 4所示。

图5 三组的细胞凋亡率

2.5 AV-PI检测细胞凋亡的AV-PI结果 细胞凋亡率三组分别为：空白对照组（4.21±1.24）%，空白载体慢病毒对照组 （3.09±1.13）%，shRNA-survivin载体慢病毒组（35.21±13.31）%，三组凋亡率差异具有统计学意义 （F=30.009，P＜0.05）， 其中 shRNA-survivin载体慢病毒组与空白对照组、与空白载体慢病毒对照组比较细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），如图5所示。

3 讨论

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族（Apoptosis inhibitor protein，AIP）成员中分子量最小的一个，是迄今为止发现的最强凋亡抑制因子[4-5]。survivin基因在大多数的肿瘤组织中呈特异性表达，比如甲状腺癌[6-7]、膀胱癌[8]、胃癌[9-10]、大肠癌[11-12]、宫颈癌[13]和食道癌[14]。survivin基因的高表达与肿瘤的复发、淋巴浸润及转移密切相关[14-15]。近年的研究发现，survivin基因与绒癌发生发展密切[16]。本研究中，作者通过RNAi的方法构建shRNA-survivin载体慢病毒转染人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞并探究各组中survivin基因的表达，探讨survivin基因的作用，以寻找治疗绒癌细胞的新靶点。

表2 三组survivin、Caspase-3及Caspase-9 mRNA的表达

Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的重要共同点是活性位点都含有半胱氨酸，并特异地断开天冬氨酸残基后的肽键[17]。本研究通过RT-qPCR方法检测survivin在人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞中凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的表达。shRNA-survivin载体慢病毒组比空白载体病毒组相比，Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平明显升高 （P＜0.05），可见 shRNA-survivin载体对人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞的凋亡作用非常明显。

另外，本研究采用Transwell的实验方法检测肿瘤细胞的迁移，结果提示，三组透过分子筛的细胞数差异具有统计学意义（P＜0.05），其中shRNA-survivin载体慢病毒组分别与空白对照组、空白载体慢病毒对照组比较均显著降低 （P＜0.05）。故shRNA-survivin在人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞的迁移中具有明显的抑制作用。

本研究还利用CCK-8实验检测肿瘤细胞的增殖。三组增殖率差异具有统计学意义（P＜0.05），其中shRNA-survivin载体慢病毒组分别与空白对照组、与空白载体慢病毒对照组比较显著降低 （P＜0.05），提示shRNA-survivin通过抑制survivin基因的表达，进而对人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞的增殖具有明显的抑制作用。

最后，本研究利用AV-PI凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡，三组凋亡率差异具有统计学意义（P＜0.05），其中 shRNA-survivin 载体慢病毒组分别与空白对照组、与空白载体慢病毒对照组比较凋亡率明显升高（P＜0.05），提示 shRNA-survivin 通过抑制survivin基因的表达，进而对人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞的过度凋亡具有明显的促进作用。

综上，shRNA-survivin通过抑制survivin基因的表达，从而对绒癌JEG-3细胞的增殖、迁移有抑制作用，对人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞凋亡具有促进作用。