激光辅助孵化在高龄不孕者冻融胚胎移植中的应用

周媛萍，刘春玲，朱玉蓉，王海燕，吴晓云

（湖州市妇幼保健院，浙江 湖州 313000）

近年来，辅助生殖技术得到了迅速的发展，但高龄不孕患者的试管婴儿成功率一直处于较低水平。辅助孵化技术（Assisted hatching，AH）是利用激光、机械或化学等方法在胚胎透明带上制造一处缺损或裂隙，有利于胚胎从透明带中孵出，增加着床，以改善临床结局的一种方法[1]。本文通过回顾性分析，探讨激光辅助孵化技术在高龄不孕患者冻融胚胎移植周期中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1月-2017年12月在本院行冻融胚胎移植且年龄≥35岁的高龄不孕患者173例，移植均在第3天的卵裂期胚胎上进行。按照是否进行激光辅助孵化随机分为两组：（1）LAH组：行激光辅助孵化（laser-assisted hatching，LAH）组78例，未行辅助孵化为对照组95例。排除标准：（1）合并子宫内膜异位症、子宫腺肌病、输卵管积水、宫腔占位、宫腔粘连；（2）甲状腺功能异常；（3）严重内外科疾病；（4）急性生殖道感染；（5）性激素应用禁忌证；（6）夫妻双方有任何一方染色体异常。两组一般资料比较差异无统计学意义 （P＞0.05），详见表1。两组年龄、体质量指数、不孕年限、内膜转化日的子宫内膜厚度、移植胚胎数、移植优胚数的比较差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

表1 两组一般基本资料比较（±s）

表1 两组一般基本资料比较（±s）

*注：优胚的标准按实验室四级评分法[2]

组别 n 年龄 （岁） 体质量指数（k g/m 2） 不孕时间（年） 转化日内膜厚度（m m） 移植胚胎（个） 移植优胚（个）*L A H 组 7 8 3 8.3±3.0 2 2.2 1±2.2 8 5.1 2±2.7 5 8.7 6±1.3 8 1.6 7±0.4 7 1.2 7±0.7 8对照组 9 5 3 8.9±3.5 2 1.9 4±2.2 4 5.2 4±3.3 3 8.5 4±1.1 9 1.7 1±0.4 6 1.1 8±0.8 7

1.2 方法

1.2.1 内膜的准备 采用激素替代内膜准备方案。患者均在月经第2～3天开始口服戊酸雌二醇（补佳乐，1mg/片，拜耳医药保健公司生产），每日 6mg，7天后加量至8mg，服用补佳乐第14天开始B超监测子宫内膜，当子宫内膜厚度≥7mm即达到标准，同时E2水平≥600pmol/L时给予肌肉注射黄体酮针 60mg/d（20mg/支，仙居制药厂）行内膜转化，补佳乐用法继续同前（8mg/d）直到第21天，如内膜厚度仍未达到标准，则放弃本周期移植。

1.2.2 胚胎解冻 内膜转化后3天开始进行胚胎解冻。胚胎均为玻璃化冷冻胚胎行玻璃化解冻。复苏胚胎标准：卵裂球存活率≥50%，卵裂球存活标准为：胞膜完整且胞质折光性好，透明带完整。

1.2.3 激光辅助孵化 对LAH组的复苏胚胎在移植前进行激光辅助孵化。激光通过显微镜经液体传导至透明带，利用热效应达到融解透明带的目的[3]。将准备移植的胚胎转移至一个体外操作皿中，在低倍镜下寻找胚胎，将物镜转到专用激光物镜下，打开激光发射器的锁定水平位，调整激光能功率、作用时间及脉冲次数，选择胚胎透明带间隙较大或碎片较多处作为孵化部位，点击发射键完成辅助孵化。对照组的复苏胚胎均未行激光辅助孵化。

1.2.4 胚胎移植 在B超定位下，将装好复苏胚胎的移植内管通过外管插至距宫底 0.5～1cm处，然后将胚胎缓慢注入宫腔，均采用COOK移植管（库克公司生产）。两组所有复苏胚胎均进行了移植。

1.2.5 移植后黄体支持 两组移植后均采用黄体酮阴道缓释凝胶（雪诺同，Merck Serono公司生产，8%（90mg/支）90mg，塞阴 1次/d+地屈孕酮片 10mg口服，2 次/d，补佳乐用法继续同前（8mg/d），行黄体支持。

1.2.6 妊娠的判断 移植后14天测血人绒毛膜促性腺激素（β-HCG），如 β-HCG＜10mIU/mL 为未妊娠，停用所有药物；如β-HCG＞10mIU/mL为生化妊娠，继续同前行移植后黄体支持。移植30天行阴道超声检查，超声下见宫内妊娠囊、或流产物见绒毛、或宫外见妊娠囊诊断为临床妊娠。明确宫内妊娠后补佳乐逐渐减量至孕8周停用，雪诺同于孕10周停用，地屈孕酮于孕12周停用。若为流产或宫外孕，则及时停药并进行相应处理，持续妊娠者按规范进行定期产前检查。

1.3 观察指标 （1）胚胎完全埋入子宫内膜中且被内膜覆盖称为“着床”，胚胎着床率=着床胚胎数/移植胚胎数×100%；（2）临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；（3）早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%；（4）异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

本文LAH组78例和对照组95例内膜厚度均达到标准。LAH组78例共解冻胚胎134枚，解冻后复苏胚胎132枚，其余2枚褪化；对照组95例共解冻胚胎165枚，解冻后复苏胚胎162枚，其余3枚褪化。褪化胚胎予废弃。LAH组共移植复苏胚胎132枚，着床33枚；移植78例者临床妊娠27例，3例发生早期流产，异位妊娠未发生；对照组共移植复苏胚胎162枚，着床20枚；移植95例者临床妊娠19例，6例发生早期流产，异位妊娠发生1例。两组妊娠结局的比较，LAH组胚胎着床率和临床妊娠率明显高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.01）；两组早期流产率和异位妊娠率差异无统计学意义（均P＞0.05），详见表 2。

表2 两组妊娠结局的比较（%）

3 讨论

冻融胚胎移植是辅助生殖技术中重要的一部分，为不适宜进行新鲜移植或新鲜移植失败的患者提供了再次移植的机会，保障了单次取卵的妊娠率。对于高龄患者，由于临床妊娠率低、促排方案等多种因素，选择冻融移植的机会更多，所以如何改善高龄不孕患者冻融移植周期的临床结局成了生殖领域刻不容缓的问题。

胚胎在子宫内的着床是一个复杂的过程，主要包括囊胚的孵出、定位、粘附及侵入等过程，其中囊胚孵出透明带是成功种植的关键步骤，但胚胎在体外培养以及冷冻解冻过程中，由于细胞内冰晶的形成和渗透压效应导致卵裂球受损，透明带变厚[4]，同时，高龄女性卵巢功能差，影响卵母细胞质量，透明带异常的可能性增加[5]，也增加了透明带孵化的难度，影响移植后胚胎的着床。辅助孵化技术有多种方法，包括机械法、激光法和酸化法等[6]，这些方法利用机械、激光或化学等方法在胚胎透明带上制造一处缺损或裂隙，利于胚胎从透明带孵出，提高胚胎着床率和临床妊娠率。其中激光辅助孵化（LAH）是目前最常用的方法，因其具有操作简单、胚胎暴露时间较短、定位准确、相对安全有效等优势而被广泛应用。

但LAH是否能提高冻融胚胎移植周期的胚胎着床率和临床妊娠率目前仍然存在着争议。国内外一些研究认为，LAH不能改善冻融胚胎移植周期的胚胎着床率和临床妊娠率[7-8]。也有很多研究[9]持相反意见。Primi等[10]对欧洲多中心前瞻性随机对照结果认为，LAH对反复着床失败患者的临床结局是有效的。黄建芳等[11]的Meta分析结果表明，行FET的患者移植前进行LAH可以提高胚胎着床率和临床妊娠率。本研究结果显示，LAH组胚胎着床率（25.00%vs12.35%，P＜0.01）和临床妊娠率（34.62%vs20.00%，P＜0.05） 均明显高于对照组，故LAH能够改善高龄不孕患者冻融胚胎移植周期的胚胎着床率和临床妊娠率。

另外，研究中LAH组的早期流产率和异位妊娠率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与多项研究得出 “辅助孵化不增加移植后流产率”的结论[12-13]相符，同时研究显示LAH并不会提高异位妊娠率。

综上，LAH能够改善高龄不孕人群冻融胚胎移植的种植率和临床妊娠率，且不影响早期流产率和异位妊娠率，此外，也有研究将LAH应用于反复移植失败、透明带异常的人群，但LAH技术毕竟是一种侵入性操作，同时激光在辅助孵化过程中产生的热量可能对胚胎造成损伤，影响胚胎发育。所以，LAH对早期不良妊娠结局的影响及远期的安全性还有待于增加样本量、延长观察时间来证实。