肝细胞癌组织中DCLK1蛋白的表达及其临床意义

梁东 黄起桢 张翔 罗柳平 黎蕴通 曾永毅

肝细胞癌(肝癌)是消化道常见的恶性肿瘤之一，为中国肿瘤死因的第2位[1]，且术后复发率高、预后差，5年的生存率仅为18%[2]。寻找有效的肿瘤标志物对肝癌的诊断和治疗均具有重大意义。双肾上腺素样激酶1 (Doublecortin-like kinase 1, DCLK1)是一种发现于有丝分裂后的神经元中的跨膜微管相关蛋白激酶[3]。近年研究发现DCLK1可能是消化系统肿瘤相关的重要标志蛋白[4]，其高表达于胰腺癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中[5-8]，但DCLK1在肝癌中的表达情况及其功能研究尚未见报道。另外，有研究显示卵圆细胞蛋白OV6可作为肝癌祖细胞的标志物，可能与肝癌的形成、转移密切相关。为了解肝癌中DCLK1表达情况以及其可能的生物学功能，本研究回顾性分析2012年6月至2015年6月福建医科大学孟超肝胆医院收治的52例肝癌病人的临床病理资料。检测DCLK1蛋白和OV6在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况，探讨两者的相关性、以及其与肝癌临床病理因素和病人预后的关系。

资料与方法

一、病例资料和材料

1.病例资料和组织样本来源 经福建医科大学孟超肝胆医院伦理委员会批准，采用回顾性横断面研究方法，收集2012年6月至2015年6月在福建医科大学孟超肝胆医院行根治性肝癌手术病人的临床资料52例，其中男性40例，女性12例，年龄28～78岁，平均年龄51岁。从我院生物标本库及病历信息中心收集病人临床资料，包括病人性别、年龄、肝硬化水平、甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤大小、肿瘤包膜等信息。纳入标准：①术前肝功能为Child-Pugh A级；②无远处转移；③术前均未进行化疗、放疗、介入治疗和免疫治疗等抗肿瘤治疗；④均行根治性肝癌切除手术；⑤病理学检查证实为肝细胞癌。排除标准：①术前肝功能为Child-Pugh B级及以下；②有远处转移；③术前接受过化疗、放疗、介入治疗和免疫治疗等抗肿瘤；④治疗非肝细胞癌，如胆管细胞癌、混合型肝癌或其他恶性肿瘤肝转移；⑤合并其他恶性肿瘤。

2.试剂及设备 兔抗人DCLK1单克隆抗体(1∶200)购自台湾Abnova公司，鼠抗人OV6单克隆抗体(1∶200)购自香港Abcam公司，二氨基联苯胺(DAB)酶显色试剂盒购自武汉博士德公司，PBS缓冲液(pH 7.4)、二甲苯、EDTA、多浓度梯度乙醇、过氧化氢等试剂均为福建医科大学孟超肝胆医院病理科提供。组织芯片机，全自动脱水机、石蜡切片机，普通光学显微镜、Olympus荧光显微镜( Leica公司)。

二、方法

1.制作组织芯片 挑选组织保留良好的供者蜡块，制作空白蜡块；将供者蜡块和空白蜡块预热至30 ℃～40 ℃备用。用穿刺针打孔，将穿好的组织推入孔内。每个空白蜡块可穿刺47个点。将含有组织的一面向下放置于载玻片上，放到65 ℃～70 ℃的烤箱里，待蜡块与载玻片之间出现液体石蜡时，迅速移去载玻片，轻轻挤压蜡块四周，自然冷却。

2.免疫组织化学 组织芯片蜡块5 μm连续切片，60 ℃烤箱中烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水浸洗，3 min /次，共3次。3%过氧化氢室温孵育10 min，EDTA煮沸法进行抗原修复；过氧化氢阻断内源性氧化物酶活性；一抗OV6抗体(1∶200)、DCLK1抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色；苏木精复染细胞核；水性封固剂封固。PBS代替一抗做阴性对照。

3.结果判定标准 观察5个高倍镜视野，阳性标准为细胞核内出现棕黄色或淡黄色颗粒。判定标准采用半定量积分法。以细胞核的染色深浅程度作为评定标准：无染色记为0，浅染色记为1，中等染色记为2，深染色记为3。以染色的肿瘤细胞核所占百分比作为评定标准：0～10%的肿瘤细胞核着色记为0，11%～25%的肿瘤细胞核着色记为1，26%～50%的肿瘤细胞核着色记为2，51%～75%的肿瘤细胞核着色记为3，76%～100%的肿瘤细胞核着色记为4。最终的免疫组化判定标准根据上述两个评定标准(染色强度和着色细胞比例) 的乘积而定：0分为无表达，≤4分为低表达，>4分为高表达。

4.随访 随访自治疗结束后开始，采用电话和门诊方式进行随访，首次治疗后3个月内随访1次，此后每6个月随访1次。随访期间定期复查彩色多普勒超声、肿瘤指标、血液生化检查、磁共振检测等。随访时间截止至2016年7月，或至病人死亡、失访。

三、统计学处理

采用SPSS (20.0版)统计学软件进行分析，根据DCLK1表达量的高低将病人分为两组，采用χ2检验及Fisher精确概率法分析DCLK1表达与临床病理特点之间的关系，两种蛋白的表达差异采用Spearman等级相关分析，同时采用Kamplan-Meier法绘制生存曲线，组间无瘤生存率差异用Log-rank检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、OV6和DCLK1在肝癌与癌旁组织中表达情况

OV6蛋白和DCLK1蛋白均主要在细胞质中表达，阳性的细胞胞质呈棕黄色。在癌旁组织中OV6表达量低或不表达(图1A)，在肝癌组织中OV6呈广泛高表达于门管区(图1B)；在癌旁组织中DCLK1表达量低或者不表达(图1C)；在肝癌组织中，DCLK1表达量明显增高，主要分布于肿瘤组织的胞质、生长活跃的区域及门管区，但不同样本之间的表达强度、数量不一(图1D)。分别统计DCLK1、OV6在肝癌与癌旁组织中的表达情况，结果显示DCLK1、OV6在肝癌与癌旁组织中的表达差异均有统计学意义(表1、表2)。

表1DCLK1在癌旁组织与肝癌组织中的表达对比[例(%)]

组别DCLK1高表达低或无表达χ2值P值癌组织18(34.6)34(65.4)5.1280.0234癌旁组织8(15.4)44(84.6)

表2 与OV6在癌旁组织与肝癌组织中的表达[例(%)]

二、DCLK1蛋白的表达与临床病理特点的关系

分析显示肝癌组织中DCLK1的表达与AFP、微血管侵犯有关(P均<0.05)，提示DCLK1可能与肝癌的增殖及干性能力相关；而DCLK1的表达水平与病人的性别、年龄、乙肝病毒载量、肿瘤直径、肿瘤数量、肿瘤包膜、肝硬化状况无明显相关性(P均>0.05)，Spearman等级相关分析提示DCLK1与OV6在肝癌组织中的表达呈正相关(r=0.505，P<0.001)，详见表3及表4。

三、DCLK1表达水平与病人的生存预后分析

所有病人均采用电话和门诊相结合的方法随访3年(有数例为2014年6月至2015年6月病例，随访生存期小于2年，但观察到终点)。自手术之日起至死亡或随访结束，最长生存期36.85个月，最短生存期2.33个月，中位生存期为14.16个月。DCLK1高表达组无瘤中位生存时间12.71个月,3年无瘤生存率为16.7%；DCLK1低表达组平均无瘤中位生存时间为25.67个月，3年无瘤生存率为46.2%。采用K-M生存分析显示两组病人术后3年无瘤生存率差异具有统计学意义(P=0.022)，详见图2。

讨 论

尽管肝癌在手术方式、介入治疗、化疗及放疗取得了一定的进步，但由于多数在发病早期没有明显症状，大部分病人在确诊时已处于中晚期阶段，且肝癌复发率高，5年生存率仍仅为18%，因此，早期诊断和治疗对于改善肝癌病人的预后意义重大，但目前肝癌仍缺少有效的协助早期诊断及判断预后的分子标志物。DCLK1是一种跨膜微管相关蛋白样激酶，主要参与骨架的形成、调节细胞运动、细胞分化以及细胞周期[9]。DCLK1蛋白在体内多种恶性肿瘤中均有表达[10-12]。因此DCLK1蛋白被认为在部分肿瘤中可作为肿瘤标志物。王欢等[13]报道DCLK1在结直肠癌组织中的表达率为36.7%，可作为结直肠癌肿瘤干细胞的标志物。位于肝索与胆管终末连接处的卵圆细胞是肝脏的重要组成细胞，是肝祖细胞的活化形式，具有多向分化潜能，OV6作为其分子标志物之一，被认为与肝癌细胞的形成与转移密切相关。Yang等[14]的研究发现OV6在肝癌组织中的高表达率为38.0%，可作为肝癌的干性指标。

表3DCLK1的表达与原发性肝癌病人临床病理学特点的关系(例)

临床病理特征例数DCLK1高表达低或无表达χ2值P值性别0.1130.736 男401426 女1248年龄1.9790.159 <50岁221012 ≥50岁30822HBVDNA0.1640.686 <1kU/ml28919 ≥1kU/ml24915AFP7.1690.007 <400μg/L33726 ≥400μg/L19118肝硬化0.1770.674 无413 有481731肿瘤数量0.5750.448 单发381226 多发1468肿瘤包膜1.7280.189 无1789 有351025肿瘤直径0.0510.820 <5cm22814 ≥5cm301020微血管侵犯4.2940.038 无33825 有19109

表4 DCLK1和OV6在肝癌组织中表达强度的相关性(例)

图2 DCLK1的表达水平与病人无瘤生存期

本研究结果显示：在肝癌组织中DCLK1的高表达率为34.6%(18/52)，OV6的高表达率为38.5%(20/52)，Spearman分析提示二者表达量呈正相关，与上述研究结果相近；且肝癌组织和癌旁组织中的表达差异有统计学意义，DCLK1在癌组织中明显高表达，在肝癌组织中DCLK1的表达情况与AFP、微血管侵犯密切相关，而DCLK1的表达情况与乙肝病毒载量、肿瘤直径、肿瘤数量、肿瘤包膜、肝硬化状态等指标无关。免疫组化结果显示肝癌组织中DCLK1同OV6蛋白共同高表达于门管区，而门管区肝细胞的功能异常是肝癌干细胞产生的来源之一[15]，因此我们认为DCLK1可能通过影响门管区肝癌干细胞的增殖及其干性，在肝癌中的发生及发展过程发挥其生物学作用。因此，DCLK1与OV6可能存在相似的生物学功能，可作为一个潜在的肝癌标志物，但其确切功能及作用机制有待进一步研究。

甘婧婧等[16]的研究结果表明：在乳腺癌中DCLK1高表达病人150个月的总生存率为37%，而DCLK1低表达病人总生存率为62.4%。孟庆彬等[17]研究结果表明：在胃癌中DCLK1高表达者的5年总生存率和5年无瘤生存率分别为39.0%和37.0%，明显低于DCLK1低表达者的65.8%和64.5%。以上研究报道均提示：DCLK1高表达的病人预后较差。本研究结果显示：在肝癌中DCLK1高表达组无瘤中位生存时间12.71个月，3年无瘤生存率为16.7%；DCLK1低表达组平均无瘤中位生存时间为25.67个月，3年无瘤生存率为46.2%。DCLK1高表达组与低表达组无瘤生存期差异有统计学意义，提示DCLK1高表达的肝癌病人预后较差，同上述研究结果一致，因此，DCLK1可能成为一个判断肝癌病人预后的指标。

综上所述，肝癌组织中DCLK1蛋白表达较癌旁组织明显升高；DCLK1蛋白表达情况与AFP水平、微血管侵犯有关，可能成为潜在的肝癌诊断及评估预后的分子标志物。但其中的分子机制有待进一步探讨，也是我们接下来的研究方向。

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