支链淀粉提取和链长分布测定方法研究进展

徐锡明 范名宇 王晓菁 李鸣晓 徐正进

(沈阳农业大学水稻研究所；农业部东北水稻生物学与遗传育种重点实验室；北方超级粳稻育种教育部重点实验室，沈阳 110866)

直链淀粉和支链淀粉属于淀粉的2个重要组成部分，在最常见谷物胚乳淀粉中，支链淀粉质量分数为72%～82%，直链淀粉在18%～28%。而糯玉米和糯稻米的支链淀粉质量分数为100%[1-3]。支链淀粉的分子质量高于直链淀粉，抗老化能力优于直链淀粉，具有强吸水性、高黏性、弱剪切性的特点[4]。支链淀粉广泛用于医学、工业、材料科学等，而且对农作物育种具有重要指导意义。准确提取支链淀粉和测定支链淀粉链长分布可以客观地评价水稻、玉米、马铃薯、甘薯等类作物品质。研究发现，支链淀粉的短链/长链比与淀粉的结晶度呈显著正相关[5]，短链支链淀粉与崩解值呈正相关而长链支链淀粉与崩解值呈负相关[6]。支链淀粉含量及其分子结构研究对作物品质育种有重要意义，而支链淀粉提取和链长分布测定方法是相关研究的基础，本文概述支链淀粉的分离和链长分布测定方法。

1 支链淀粉的提取

在进行支链淀粉测定前，首先将试样(如精米、玉米籽粒、小麦籽粒等)粉碎，过60目筛得到待测淀粉，经索氏抽提去除试样中的脂肪，得到脱脂淀粉[7-11]。支链淀粉的提取方法按照是否使用化学试剂分为物理提取法(如温水提取法)和化学提取法(如正丁醇提取法)，按照分离方式分为溶解度提取法和结构区分提取法，不同提取方法的比较见表1。

1.1 温水抽提法

温水抽提法又名有选择沥滤法，是最早使用的支链淀粉提取方法。将脱脂的淀粉在其糊化温度或稍微高于淀粉糊化温度的热水中搅拌和抽提。其原理是直链淀粉具有抗溶胀性，易溶于热水；而支链淀粉在热水中膨胀且难溶于热水。温度在稍高于糊化温度时，直链淀粉分子团粒完整的溶于水中,大多数支链淀粉以氢键结合以结晶态保留在团粒中。为防止在有氧状态下部分支链淀粉氧化分解成直链淀粉，应在氮气流下用0.5 mol/L NaOH溶液悬浮30 min,然后40 000 g速度离心2 h,上部清液经过中和、浓缩、脱水后得直链淀粉，下部沉淀得到支链淀粉[11-14]。

温水抽提法优点是分离方法简易，能耗小，成本低；不足之处是糊化温度的控制是分离直链淀粉和支链淀粉的关键，糊化控制不当则会造成分离不纯、效率偏低，有氧条件下部分抽提的支链淀粉氧化分解成低分子直链淀粉。

1.2 盐类分级沉淀法

该方法常用于工业提取直链淀粉，利用直链和支链淀粉在相同盐溶液浓度下盐析温度相异的原理[11,14]。直链淀粉在80 ℃时沉淀，而支链淀粉不沉淀。常用的盐溶液有硫酸钠、硫酸铵和硫酸镁溶液。以硫酸镁溶液分离法为例，将质量分数为10%～13%硫酸镁溶液,加入10%淀粉水溶液(通过SO2、MgO调节其pH值6.5～7.0，以防止淀粉降解)。加压加热淀粉溶液至160 ℃使之溶解,然后冷却至80 ℃，40 000 g离心，将沉淀的直链淀粉分离。继续冷却至20 ℃,得到支链淀粉沉淀。有报道用于马铃薯淀粉的提纯[14]。由于硫酸镁溶液成本较高，可以根据Cantor等[15]的研究，将硫酸镁可替换为氯化钙溶液，然后再用氢氧化钙沉淀，逐步加水可以得到分级效果[16]。从而将直链淀粉和支链淀粉分离。

表1 不同支链淀粉提取方法比较

其优点是没有加入有机化学试剂，保证淀粉测定不受到有机试剂干扰，适用于直链淀粉和支链淀粉的大量生产，效率高，纯度可达90%，且硫酸镁溶液可反复使用；缺点是分离操作较为困难。

1.3 凝沉分离法

凝沉分离法又称回生和控制结晶法，原理是利用直链淀粉易于形成结晶状沉淀的性质进行分离。淀粉溶液在低温静置条件下,直链淀粉分子就缓慢渗出，如果适当地降低温度,则直链淀粉分子将从溶液中结晶。浓度过高或温度过低低，直链淀粉分子的结晶受阻，形成一种三维凝胶网络，即淀粉的凝沉现象。将质量分数为10%的淀粉溶液pH值乳调至6.5，喷入高压蒸汽。加热到150 ℃，随后降低气压至正常大气压，4 h内温度降至30 ℃，直链淀粉结晶沉淀，将母液干燥得到支链淀粉[16-20]。一般用于玉米、马铃薯为原料的直链和支链淀粉制备。

此法优点是所分离的直链淀粉和支链淀粉没有化学试剂污染；缺点是耗时长，能耗较高，需高温高压条件进行分离。

1.4 混合溶剂分离法

混合溶剂分离法又称配合剂分离法，是目前使用最为广泛的支链淀粉提取方法[14-16]。其原理是将可与直链淀粉形成复合物的试剂加入淀粉糊液进行冷却，使复合物沉淀出来，分离直链淀粉和支链淀粉，从而得到支链淀粉。可用于百里酚、高级脂肪酸、溶血卵磷脂、硝基化合物(如硝基丙烷、硝基链烷烃)、氯化乙烯、丁酮等作为分离试剂。是目前实验室分离和制备直链淀粉和支链淀粉的主要途径。

1.5 纤维素吸附法

根据纤维素只吸附淀粉溶液中直链淀粉的特性对淀粉进行分离，冷淀粉溶液通过脱脂的棉花柱,直链淀粉被吸附,支链淀粉通过，得到纯度高的支链淀粉[16,24]。

该方法提取支链淀粉的能力有待提高，一般用于对盐类沉淀法得到的支链淀粉进行进一步提纯。优点是操作简便，没有化学试剂污染，淀粉分离彻底；缺点是无法进行大量支链淀粉制备，需要消耗大量脱脂棉。

1.6 电泳法

根据支链淀粉和直链淀粉含有不同电荷的属性，可电泳分离淀粉[16,24]。例如马铃薯的支链淀粉含有少量具有负电荷的磷酸，将淀粉溶液置于电场中，支链淀粉移向阳极沉积，得到支链淀粉。玉米淀粉则是直链淀粉吸附有脂肪酸，具负电荷，将淀粉溶液置于电场中，直链淀粉向阳极移动沉淀下来，而支链淀粉留在溶液。

该方法仅适用于含有不同电荷直链淀粉和支链淀粉分离，没有明显差别电荷的淀粉不适用此方法分离。

1.7 凝胶过滤层析法

根据直链淀粉和支链淀粉两者的分子量不同的特性,可以使用凝胶过滤层析分离。淀粉溶液通过层析柱,分子直径大的支链淀粉分子经过凝胶颗粒间空隙,与洗脱液一起移动流出柱外；而分子直径比小的直链淀粉分子,能够进入凝胶相内,移动的速度落后于支链淀粉分子[16,24-25]。该法分离的支链淀粉纯度高，一般用于支链淀粉链状分布的测定和支链淀粉的提纯。在链长分布测定时，该方法为主要分离方法，其优点在于节省分离时间和提高效率；缺点是成本高，上样量少。

2 支链淀粉链长分布测定方法

目前测定支链淀粉链长分布的方法有很多，主要是2种方法：液相色谱法(HPLC)和荧光糖电泳法(FACE)，此外还有分光光度计法，如表2所示。

2.1 液相色谱法(HPLC)

在采用液相色谱法测定支链淀粉链长分布前，一般先将已提纯的支链淀粉的脱分支处理：在40 ℃左右条件下，通过异淀粉酶将纯化的支链淀粉进行脱分支48 h，随后15 min沸水浴将异淀粉酶灭活，冷却离心10 min，随后去掉沉淀，取上清液，得到脱分支的支链淀粉试样[25-26]，随后上机测试。

2.1.1 高效空间排阻色谱-示差折光检测法(HPSEC-RI)

高效空间排阻色谱法(HPSEC)又称为高效分子排阻色谱法、高效凝胶色谱法(HPGPC)。主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系进行分离的一种色谱方法[27-28]。

空间排阻色谱法(SEC)于1964年由Moore[29]首先研究成功的色谱方法。是一种流动相与控制孔径分布的固定相接触，使溶质按分子体积大小分离的色谱方法[30]。一般来说，分离和鉴定小分子物质，并且用来分析相同分子体积的不同高分子同系物的化学性质，是以有机溶剂为主要洗脱剂的凝胶色谱法。

高效空间排阻色谱-示差折光检测法(HPSEC-RI)在凝胶渗透色谱基础上改进[31-32]。袁辛娅等[28]通过该方法，对羟乙基淀粉的分子质量进行了测定。刘艳群等[33]进一步测得淀粉的相对分子质量分布。此方法优点是所需溶剂易于配制，步骤简单，易于操作，但是上样量小，仅为柱体积的1%，而且对流速也有严格的限制。

杨小雨等[31]研究，将Shodex SB-G保护柱接于前方，2根分析色谱柱Shodex SB-803(1 000-100 000)和Shodex SB-802.5(300～10 000)按由大到小分离范围串联，柱温40 ℃，0.1 mol/L Tris+0.1 mol/L NaCl (pH=7.40)为流动相，流速0.5 mL/min，并使用示差折光检测器进行检测。通过支链淀粉标样，得到计算公式，再依据标样分子质量MW计算，DP(聚合度)=MW/162。所得典型双峰曲线依据峰值归一化积分的原理[26,31]，通过峰值分析确定支链淀粉链长比例[32-33]。

该方法测定周期短，重复性好，适宜对作物支链淀粉质量分布进行测定。缺点是所需操作较难，运行成本较高，无法像高效阴离子交换色谱那样对支链淀粉链长进行精细定位，只能通过液相色谱的出峰面积将支链淀粉链长分为4组，分别为Fa(6≤DP≤12),Fb1(13≤DP≤24),Fb2(25≤DP≤36),Fb3(37≤DP≤60)。

2.1.2 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)

高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)是至今较为成熟的支链淀粉链长分布测定方法[34-35]。20世纪80年代以来，该方法广泛应用于糖类的分析，属于糖类检测的首选方法[36-38]。应用离子交换的原理为：以有机离子交换树脂为填料类型，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子，苯乙烯二乙烯苯共聚体为骨架，在苯环上引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂，该类交换树脂具有多孔或薄壳型或大孔表面层型的物理结构，以便于快速达到交换平衡。支链淀粉作为多糖，也可使用该方法[39]。

贺伟等[34]的研究对高效离子交换色谱-脉冲安培检测法进行了改进。将原有的单糖和二糖测定柱PA-10和PA-20的测定范围扩大，节约了色谱柱开销，优化色谱条件，得到较高响应值、检测到较大的聚合度结果。该方法用于支链淀粉链长分布的测定。

表2 支链淀粉链长分布测定方法比较

该方法可以更准确的得到支链淀粉链长分布图，每个单一色谱峰的分子聚合度信息均可得到，检测的范围是DP<80[40-42]，缺点是仪器要求较高。

2.2 荧光辅助糖电泳法(FACE)

荧光辅助糖电泳也称荧光标记糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析前需要将糖类预衍生，目前8-氨基萘基-1,3,6-三磺酸(ANTS)是广泛应用于糖类预衍生，为糖类提供了生色(荧光)基团和3个负电荷，在pH缓冲液和电场力作用下产生电迁移。将衍生后的糖类进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，用电泳仪分析一系列浓度的糖类标准品,来确定此方法的灵敏度和测量范围。记录荧光强度的变化，据此可以计算糖类的相对丰度[43]。此方法周期长，重复性较差，但设备要求不高。

Nakamura等[44]对其和毛细管电泳结合进行了改进，从而更适宜进行支链淀粉的α-1,4-葡聚糖链长度分布的测量。改进Umemoto[45]和 O’Shea等[46-47]的方法，使用离心真空蒸发器和寡糖谱分析试剂盒进行荧光标记和毛细管电泳记录荧光强度的变化，分析支链淀粉链长分布。可将支链淀粉链长分为长链型(L型)和短链型(S型)两类型。L型支链淀粉ACR(DP≤10/DP≤24)小于0.20,而S型支链淀粉的ACR大于0.24。该方法测定支链淀粉链长分布较为准确，但操作较为繁琐，对实验人员要求高，使用四氢呋喃和氰基硼氢化钠时应注意安全，以免爆炸和中毒。

贺晓鹏等[48]和Murray等[49]在Nakamura等[44]的研究基础上，将其改进为基于DNA测序仪的荧光糖电泳。应用ABIPRISM 377 DNA 测序仪进行电泳。在电泳结束后，利用Genscan 3.1.2收集、导出支链淀粉数据，得到支链淀粉链长分布。该法可以准确测定DP<55的支链淀粉链长分布。缺点是所用仪器价格高昂，对实验人员要求高。

2.3 分光光度法

分光光度法常用来测定支链淀粉含量的方法，一般用于测量支链淀粉的链长分布，如紫外-可见分光光度法和多波长分光光度法。

2.3.1 紫外-可见分光光度法

通过分枝链长分析。去分枝链的平均链长用每管的可溶性总糖与还原值的比值来表示。使用硫酸-苯酚比色法对吸光度进行测定[18]，分析可溶性总糖，使用3,5-二硝基水杨酸比色法对还原值进行测定，每管中收集的分枝链平均链长为每管中总糖：还原值，从而计算得到支链淀粉的链长分布；在分析稻米支链淀粉链长分布的同时，将支链淀粉链长分成DP>100的FrI区、DP在44～47之间的的FrII区、DP在10～17的FrIII区[27]。

该方法优点是对设备要求低，缺点是无法对支链淀粉链长分布进行精细定位。

2.3.2 全波段扫描分光光度法

对淀粉扫描液进行扫描，得到碘-支链淀粉复合物的吸收光谱后，确定支链淀粉的测定波长和参比波长，按照回归方程求出支链淀粉含量[4,49-50]。

Nakamura等[51]通过与HPAEC-PAD的对比，推导计算λmax。在200～900 nm波长条件下，可以得到AAC(表观直链淀粉含量)数值，根据λmax和测定曲线的峰面积，快速计算Fa(6≤DP≤12)、Fb3(37≤DP≤60)和抗性淀粉的链长含量分析。测得优质水稻品种的支链淀粉链长分布，并对其进行品质分析。该法简便快捷，测试周期短，易于大量测定。不足在于该方法无法将13-36的DP支链淀粉进行分析。目前该方法还在完善阶段[51-53]。

3 讨论和展望

目前，支链淀粉提取方法的提取周期过长问题亟待解决。在现有支链淀粉提取技术基础上，对支链淀粉的链长分析逐步深入研究。支链淀粉链长分布测定已不再局限于食品和材料专业。医疗方面通过对支链淀粉链长分布进行新型药品和医用材料的研发[16,28,33]；农业方面已逐步将支链淀粉的链长分布测定应用在育种改良和品质标准制定等方面。其中以马铃薯、玉米、小麦、水稻方面的分析居多。根据支链淀粉的链长分布分析，可以对马铃薯淀粉改良、特种玉米育种、小麦品质改良和水稻品质食味改良进一步深入研究。

在现有链长分布技术基础上，为了规避不同方法的检出限制，已出现2种或3种方法同时联用分析支链淀粉链长的报道[47,51-53]。DP的检出范围单一，能耗高，程序繁琐仍然是现阶段各个支链淀粉链长分布测定方法普及的限制因素。

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