栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注模型大鼠皮质内质网应激相关因子表达的影响

陈喆鸣，南丽红，谢晴晴，黄 枚

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

脑缺血再灌注损伤是脑缺血疾病中常见的现象，其病理生理过程十分复杂，主要包括氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、Ca2＋超载等，最终引起神经细胞凋亡乃至坏死。近年来研究已证实脑缺血再灌注损伤引起的活性氧蓄积和细胞内Ca2＋紊乱极易发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），继而导致细胞凋亡，这可能是神经细胞凋亡的关键环节［1］。因此，ERS成为三大调控细胞凋亡的主要细胞内信号转导通路之一。栝楼桂枝汤出自《金匮要略》，已有研究表明栝楼桂枝汤具有抗炎、抗氧化应激和抗兴奋性氨基酸毒性的作用［2-3］，而课题组前期研究亦表明栝楼桂枝汤通过调控多条信号通路发挥保护神经作用，减少脑梗死体积［4-5］，具有抗神经细胞凋亡的作用［6］，但其作用是否与ERS相关，目前尚未见相关报道。因此，本研究以ERS为切入点，观察栝楼桂枝汤对ERS关键蛋白葡萄糖调节蛋白 78 （glucosere-gulatedprotein，GRP78）、转录活化因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）、C／EBP 同源蛋白（C／EBP homology protein，CHOP）及其下游细胞凋亡相关指标B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell leukemia／lymphoma gene number 2，Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）mRNA 表达的影响，为其促进脑卒中后神经功能康复提供一定的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量（270±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（浙）2014-0001，饲养于福建医科大学实验动物中心。

1.2 实验药物 大枣（北京同仁堂健康药业福州有限公司，批号：20150910）；甘草（福州回春中药饮片厂有限公司，批号：15060901）；桂枝（亳州市永刚饮片厂有限公司，批号：160113）；天花粉（北京同仁堂健康药业福州有限公司，批号：20151202）；白芍（北京同仁堂健康药业福州有限公司，批号：20151123），生姜（福建承创堂药店）；尼莫地平（山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司，批号：150601）。

1.3 实验试剂 Trizol、逆转录试剂盒、ChamQTMSYBR®Color qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）；氯仿（衡阳市凯信化工试剂有限公司）；异丙醇（广东省化学式工程技术开发研究中心）；无水乙醇（西陇科学股份有限公司）。

1.4 实验仪器 ABI 7900实时荧光定量PCR仪（美国 Applied Biosystems公司）；PrimoR台式高速冷冻离心机（美国 Thermo Fisher公司）；C1000TMThermal Cycler PCR仪（美国Bio-rad公司）。

1.5 PCR引物 PCR引物由上海铂尚生物技术有限公司参照Gen Bank数据库合成并验证。GRP78：上游 5'-GACCTGGTTCTGCTTGATGTG-3'，下游5'-TCGTTCACCTTCGTAGACCTT-3'；ATF4：上游 5'-GCCTGACTCTGCTGCTTATATTAC-3'，下游 5'-CGA GAACCACGAGGAACAC-3'；CHOP：上游 5'-CCTCG CTCTCCAGATTCCA-3'，下游 5'-CTCCTGCTCCTTC TCCTTCA-3'；Bcl-2：上游 5'-GATGACTTCTCTCGT CGCTACCGT-3'，下游 5'-GGAGAAATCAAACAGA GGTCGCAT-3'；Caspase-3：上游 5'-ACGGCAAGTT CAACGGCACAG-3'，下游 5'-TGTGAACTTGGTTGG CTTGT-3'；GAPDH：上游 5'-CAACGGGAAACCCA TCACCA-3'，下游 5'-ACGCCAGTAGACTCCACGAC AT-3'。

2 实验方法

2.1 栝楼桂枝汤的制备 称取2个处方量的药材：栝楼根 60 g，桂枝 18 g，白芍 18 g，大枣 18 g，生姜18 g，甘草12 g，将药材初步粉碎，置于圆底烧瓶中，加入10倍量的超纯水浸泡30 min后回流提取，共2次，每次1.5 h。纱布过滤后，合并滤液。将药液浓缩到100 mL至实验所需浓度1.44 g／mL。

2.2 分组、造模与干预 将大鼠随机分为假手术组和造模组，造模组建立大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，具体操作：将大鼠按60 mg／kg腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉，颈部皮肤消毒后切开，钝性分离左侧胸锁乳突肌，暴露大鼠颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉；用缝合线于近心端结扎颈总动脉和颈外动脉，用血管夹夹闭颈内动脉血流；于颈总动脉剪一切口，往颈内动脉方向插入线栓，栓塞2 h后拔出。假手术组除不插入线栓外其余操作相同。待动物完全苏醒后进行Longa神经功能评分［7］，神经功能评分3～4分视为造模成功，评分过程至少由2人同时进行。

将造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。于造模当日待大鼠完全清醒后，低、中、高剂量组分别予栝楼桂枝汤按 3.6、7.2、14.4 g／（kg·d）灌胃，阳性对照组给予尼莫地平混悬液按 1.05 g／（kg·d）灌胃，假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续干预7 d。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 神经功能损伤评分 采用Longa神经学评分法［7］对干预7 d后6组大鼠进行评分。大鼠神经功能无缺陷，记0分；缺血侧对侧前肢无法伸展，记1分；缺血侧对侧前肢屈曲，记2分；大鼠轻度向缺血对侧转圈，记3分；若严重转圈，记4分；大鼠向缺血侧对侧偏瘫，记5分。

2.3.2 内质网应激相关因子基因表达 采用实时荧光定量 PCR法检测大鼠皮质 GRP78、ATF4、CHOP、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达情况。使用Trizol法提取大脑皮质总RNA，参照试剂盒方法逆转录成cDNA，以逆转录产物为模板，通过RT-qPCR检测指标基因的表达。qPCR反应体系为20 μL，其中 Mix 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模版 DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR 扩增条件为 95 ℃预变性30 s，95℃变性10 s后退火至60℃变性30 s，共进行40个循环，熔解曲线以机器本身默认程序获得。本研究选用GAPDH为内参，计算各组样品的2－△△Ct值并进行归一化处理。

2.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（）表示，方差齐者采用单因素方差分析LSD检验法，不符合正态分布采用非参数Kruskal-Wallis检验法；等级资料采用非参数检验。

3 结 果

3.1 6组大鼠神经功能损伤评分比较 见表1。

表1 6组大鼠神经功能损伤评分比较（） 分

表1 6组大鼠神经功能损伤评分比较（） 分

注：与假手术组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

组别假手术组模型组阳性对照组低剂量组中剂量组高剂量组n 14 14 14 14 14 14神经功能损伤评分0 2.86±0.771）1.43±0.512）2.29±0.473）1.64±0.632）1.50±0.522）

3.2 6组大鼠皮质内质网应激相关因子mRNA表达比较 见表2。

表2 6组大鼠皮质内质网应激相关因子mRNA表达比较（n＝6，）

表2 6组大鼠皮质内质网应激相关因子mRNA表达比较（n＝6，）

注：与假手术组比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05；与模型组比较，3） P＜0.01，4） P＜0.05。

组别假手术组模型组阳性对照组低剂量组中剂量组高剂量组GRP78 1.04±0.27 2.10±0.191）1.14±0.233）1.72±0.143）1.41±0.223）1.01±0.093）ATF4 1.01±0.12 2.29±0.361）1.24±0.163）1.44±0.193）1.49±0.243）1.54±0.223）CHOP 1.06±0.34 1.90±0.331）1.20±0.203）1.41±0.244）1.04±0.393）1.11±0.233）Bcl-2 1.05±0.35 0.52±0.212）0.90±0.114）0.81±0.134）0.91±0.164）0.83±0.164）Caspase-3 1.02±0.20 1.90±0.121）1.16±0.113）1.48±0.093）1.30±0.143）1.23±0.083）

4 讨论

内质网是由内膜构成的封闭网状细胞器，是真核细胞中Ca2＋贮存和蛋白质合成、折叠、转运的主要场所，在维持细胞内环境稳态和细胞正常生理活动中发挥重要作用［8］。内质网对细胞内环境稳态的变化十分敏感。ERS是由于细胞内环境稳态破坏后引起的内质网功能障碍，其与脑缺血再灌注损伤关系密切。最初，Petito等［9］通过电镜发现全脑缺血再灌注损伤后神经元出现内质网结构改变并伴有迟发性神经元死亡；Paschen［10］发现神经细胞具有发达的内质网且脑缺血后出现ERS，提示ERS参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。随后的研究指出脑缺血再灌注损伤发生后，细胞内环境稳态的破坏容易引起蛋白合成受阻，大量未折叠或者错误折叠的蛋白于内质网腔中聚集，引发未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。 UPR 是介导 ERS最重要的信号机制，其在ERS初期对细胞内环境稳态的恢复具有积极的意义，但持续的应激将会激活下游的细胞凋亡信号通路，引起细胞凋亡［11］。

GRP78与CHOP是ERS的特征性指标，二者的病理性表达水平升高预示着ERS的发生以及由其介导细胞凋亡途径的激活［12］。在正常生理状态下，GRP78与相关的内质网跨膜蛋白以复合物的形式存在，抑制ERS的激活；但当脑缺血再灌注损伤发生时，GRP78将会解离并大量表达，促使ATF4转录、翻译并发生转位，进而上调CHOP表达水平［13-14］。CHOP是ERS和细胞凋亡级联反应中的关键节点，是ERS特异性的中间信号分子。其在正常生理状态下表达水平较低，但当ERS发生时CHOP的表达水平将会升高，并抑制下游Bcl-2的表达，进而促进Caspase-3的释放以及Caspase依赖性凋亡途径的激活［15］。

本研究结果显示，栝楼桂枝汤可明显减轻MCAO模型大鼠的神经功能症状，这与前期的研究结果相一致［4］。本研究经检测发现MCAO模型大鼠缺血侧皮质中 GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA 表达明显增多，而Bcl-2 mRNA的表达明显减少，提示脑缺血再灌注损伤后ERS的启动以及其下游细胞凋亡信号通路的激活。栝楼桂枝汤治疗后可明显下调 GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA的表达，上调Bcl-2 mRNA的表达，提示栝楼桂枝汤可显著下调ERS水平，抑制下游凋亡通路的传导而发挥治疗作用。mRNA是蛋白翻译的模板，基因的表达是蛋白表达的基础和前提。本研究由于时间和经费所限，目前虽只检测基因表达，但为今后进一步研究上述基因及其上下游蛋白的表达提供前期实验基础。

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