肾癌组织中卷曲螺旋结构域蛋白62的HLA-A2表位肽的筛选和鉴定

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(1.郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052；2.郑州大学生命科学学院，河南 郑州 450001)

肾癌在全球恶性肿瘤之中占3%,发病率和病死率均较高[1]。而且,肾癌对于化疗和放疗的治疗效果都不太理想，并且尚未发现十分有效的辅助治疗方法。细胞毒性T细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)是淋巴细胞的一种，这种淋巴细胞就是专门的CD8+T细胞,这种特定类型的免疫淋巴细胞可以消灭另一种特定的细胞。CTL在与肿瘤研究相关的领域里面发挥着独特的意义。能消灭另一种特定细胞的关键就在一种特殊的复合物。这种复合物的特点就是抗原肽和目的肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ合在一起，从而才能被CD8+T细胞发现进而发生消灭肿瘤细胞的行为。卷曲螺旋结构域蛋白62(coiled-coil domain containing patients 62， CCDC62)是一种肿瘤-睾丸抗原。正常的机体组织中，仅能在睾丸组织中检测到CCDC62的mRNA表达，但在结直肠癌、胃癌、头颈癌、肾癌等肿瘤组织中也有一定的表达[2]。目前，用于治疗各种肿瘤的肽疫苗正处于临床研究的活跃阶段。抗原肽需要针对特定的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分型进行预测。在我国人群中，HLA-A2的分型占到了45%左右。因此，针对HLA-A2的表型预测有着很重要的意义[3]。本研究通过NetCTL1.2软件进行生物信息学综合预测，筛选出得分较高的抗原表位，并进一步进行CCDC62表位肽表位的筛选和鉴定。

1 材料与方法

1.1材料T2A2细胞由郑州大学生命科学学院实验室常规保存，采用体积分数5% CO2、37 ℃条件下常规培养。外周血单个核细胞采集自郑州大学第一附属医院的肾癌患者，所有病例均经病理学检查确诊。该研究已经获得了郑州大学第一附属医院伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1 HLA-A2分型表位肽的预测 用NetCTL 1.2网站(http://www.cbs.dtu.dk /services /NetCTL/)对目的癌睾抗原CCDC62进行序列的预测和分数评定。根据分数情况，选择得分大于1.0的表位肽进行合成。

1.2.2 HLA-A2限制性CTL表位肽的合成和鉴定 课题组根据得分选定的表位肽委托郑州派和泰德医药科技有限公司来进行制作合成，并且通过进行高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)的分析与纯化步骤之后，这些肽的纯度>95%。并且通过HPLC检测之后，这些抗原肽的相对分子质量与理论值相符合，可以进行下一步的实验。

1.2.3 HLA-A2分子与合成后的表位肽进行结合力实验 培养T2A2细胞至生长旺盛的时期，用伊思柯夫改良培养基 (Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM)洗涤3遍，细胞密度调为 2 ×106·L-1，加入48孔板。每孔加入肽和β2-微球蛋白的量为25 μg、0.25 μg。在体积分数5% CO2、37 ℃条件下培养18 h以后，使用预冷的PBA溶液再次洗涤3遍，每个样品加入0.5 μL的抗人HLA-A2抗体。在4 ℃冰箱里面不被光照的条件下经过30 min，用PBA溶液洗涤再上流式细胞仪检测，结果用荧光系数(flourescence index，FI)表示。FI=(表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度。高等结合是FI>1.0，中等结合是FI为0.5～1.0之间，低结合是FI<0.5[4]。

1.2.4 CTL的诱导 对来自肾癌患者的20 mL外周血进行分类，加入抗体后经流式细胞仪进行筛选检测，结果证明为HLA-A2阳性后。配制含有淋巴细胞分离液的混合溶液然后通过密度梯度离心的方法，收集培养外周血单个核细胞。培养基是含有体积分数10%胎牛血清的IMDM培养基，在24孔板中培育时的细胞浓度调为2×106·L-1。第1天后每孔加入肽50 mg·L-1、β2-微球蛋白0.5 mg·L-1。第3天，加30 u·mL-1的重组人白介素-2,间隔1 d加重组人白介素-2，刺激周期1周。第2轮的诱导从第8天开始，重复第1轮的操作，但是要在第3天加入CD3刺激性抗体。刺激3轮后，培养至21 d，收集细胞。经过以上过程的细胞就是效应细胞，即CTL。实验中需要的靶细胞是荷肽的T2A2细胞，用无血清的IMDM培养基来调细胞密度。

1.3数据分析流式细胞仪得出的数据结果用FlowJo软件进行分析，并用GraphPad Prism软件制图和分析结果。

2 结果

2.1CCDC62的HLA-A2限制性表位的预测结果依据NetCTL1.2软件的结果，选择得分>1.0的表位肽。见表1。

表1 CCDC62的HLA-A2限制性表位预测结果

2.2表位肽与HLA-A2分子结合力实验结果使用流式细胞仪进行检测，对所得到的数据进行处理，结果表明CCDC62-P137和CCDC62-P141这2条肽都有较好结合力(FI>1.0)。见表2。

表2 候选肽与HLA-A2分子的结合力结果

2.3细胞内因子染色实验来检测T细胞释放IFN-γ的水平细胞内因子染色检测表位肽诱导外周血单个核细胞产生IFN-γ+CD8+T细胞的比例。负载抗原肽(50 mg·L-1)的T2A2细胞作为靶细胞，效应细胞来自抗原肽(10 mg·L-1)体外诱导的肾癌患者外周血单个核细胞。以磷酸盐缓冲液(PBS)替代作为本实验的空白对照组，HBcAg18-27替代作为本实验的阴性对照组。表位肽P137相对于对照组能激发产生更多的IFNγ+CD8+T细胞。见图1。

3 讨论

肾癌这种肿瘤疾病对广泛用于其他肿瘤疾病的放疗和化疗的效果都没有较好的反馈。如今，分子免疫学和生物信息学在不断发展，为我们通过免疫治疗方法治疗恶性肿瘤提供了支持和保障。目前，肿瘤的免疫治疗是肿瘤的研究热点和前沿方向[7-8]。

图1 肾癌患者外周血单个核细胞经过CCDC62

肿瘤疫苗的研究为肿瘤的治疗和预防提供了新的思路和方法，并且近几年有着极大的进步与发展[9]。肿瘤疫苗的原理是用患者本体的免疫细胞来杀伤肿瘤细胞。因此，与放疗和化疗比较，有着极大的优势，且治疗方案所导致的不良事件明显减少，且症状也减轻[10]。肿瘤细胞的表面有多种抗原肽，这些抗原肽可以特异性激发免疫细胞的应答反应[11]。

使用生物信息学预测肿瘤的抗原表位，可以更加有针对性，且能够缩短实验周期，提高实验效率。NetCTL 1.2既有MHC分子根据位点结合多肽的原理，并有CTL表位和其源蛋白组成的数据集，因此有较高的预测准确性[12]。

在本次研究中，使用肾癌患者的外周血，简化了体外实验及体内实验2次验证的步骤，同时也缩短了实验时间，并且所采取的方案和所得结果具有更高的参考价值[13]。本课题组后期的工作就是进一步拓展研究的范围，一方面查找新的抗原，合成验证新肽的活性；另一方面，对现有的表位肽进行改造加工，增强其活性。并且本课题组将继续扩大样本量，进行表位肽活性的验证。