X线照射、顺铂及X线照射+顺铂对CC趋化因子受体7表达的影响

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(1.福建省肿瘤医院、福建医科大学附属肿瘤医院放疗科，福建 福州 350014；2. 福建省肿瘤医院、福建医科大学附属肿瘤医院放射生物研究室，福建 福州 350014；3. 福建省人民医院放射科，福建 福州 350004；4.厦门大学附属中山医院放疗科，福建 厦门 361000)

恶性肿瘤是危及人类生命的常见原因之一，最近研究表明，趋化因子受体及其配体在肿瘤细胞的特异、定向转移中发挥着重要作用[1-3]。目前已发现约50种趋化因子及20余种趋化因子受体[4]。趋化因子受体及其配体在众多肿瘤中表达明显增加[5]。在本研究主要分析CC趋化因子受体7(CCR7)在大肠癌SW480细胞、肺癌SPC-A1细胞、鼻咽癌CNE-2细胞中的表达，同时观察不同X线照射剂量和方案、不同的顺铂浓度及同步X线照射+顺铂作用后CCR7表达的变化，从而为明确肿瘤细胞的转移机制和控制肿瘤细胞远处转移提供进一步的分子生物学基础。

1 材料与方法

1.1细胞株将大肠癌SW480细胞、肺癌SPC-A1细胞、鼻咽癌CNE-2细胞培养于RPMI-1640完全培养基中，常规传代培养，待细胞生长至对数生长期进行相关实验。

1.2照射方法及顺铂配制采用6 MV-X线照射，剂量率350 cGy·min-1，照射野大小：40 cm×40 cm，源皮距100 cm；根据实验设计，将顺铂用RPMI-1640培养基配制成实验浓度。

1.3实验分组方案单次照射SW480细胞、SPC-A1细胞及CNE-2细胞0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy 6 MV-X线24 h、48 h后观察其CCR7表达变化:1)比较单次不同剂量X线照射后不同时间CCR7的表达：单次0 Gy、2 Gy、10 Gy和20 Gy X线照射SW480细胞、SPC-A1细胞和CNE-2细胞24 h、48 h后，检测CCR7的表达；2)不同X线照射方案对SPC-A1细胞CCR7表达影响： 8 Gy单次X线照射与2 Gy·d-1连续照射6 d这2种方案作用于SPC-A1细胞后24 h和48 h，比较观察CCR7表达的变化；3)比较不同浓度顺铂不同作用时间后CNE-2细胞CCR7表达变化：将CNE2细胞培养于含0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、20 μg·mL-1顺铂培养基中24 h、48 h后，比较观察CCR7表达的变化；4)观察X线照射、顺铂及X线照射+顺铂对CNE-2细胞CCR7表达的影响：单纯2 Gy·d-1连续照射6 d，0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8μg·mL-1、20 μg·mL-1顺铂，2 Gy·d-1连续照射6 d+0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1或20 μg·mL-1顺铂这些方案作用CNE-2细胞48 h后，比较观察分CCR7表达的变化。

1.4采用Westernblot法检测各细胞CCR7表达收集各处理因素作用后的细胞，通过Micro-BCA试剂盒法将蛋白含量调成等浓度，并在100 ℃沸水中煮5 min使其变性，将等量的蛋白加入质量分数15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白被转移到聚偏氟乙稀膜上，加入约50 μL的CCR7一抗多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司，1150)3 h后，用15 000的二抗孵育1 h，曝光后洗片，将胶片置于白光下进行分析、扫描，使用Quantity one软件分析各条带。

2 结果

2.1不同剂量X线单次照射不同时间后SW480细胞、SPC-A1细胞及CNE-2细胞CCR7表达的变化3)SW480细胞：2 Gy和10 Gy X线照射24 h后，SW480细胞中CCR7的表达高于0 Gy组，且随照射剂量的增加而增加(P均<0.05)；与10 Gy组比较，20 Gy组的CCR7表达没有进一步增加(P>0.05)。照射48 h后，各剂量组CCR7的表达较0 Gy组增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy组之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。0 Gy组、2 Gy组CCR7的表达48 h较24 h增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)，而10 Gy组、20 Gy组48 h与24 h比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 不同剂量X线单次照射

2)SPC-A1细胞：0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy X线照射SPC-A1细胞24 h后各组SPC-A1细胞CCR7表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy X线照射SPC-A1细胞48 h后各组SPC-A1细胞CCR7表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。各剂量组照射24 h、48 h后SPC-A1细胞CCR7表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

图2 不同剂量X线单次照射

3)CNE-2细胞：照射24 h后，各剂量组CCR7的表达较0 Gy组增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy组之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。照射48 h后，各剂量组CCR7的表达较0 Gy组增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy组之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。各剂量组照射48 h后CCR7表达均较照射24 h后明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 不同剂量X线单次照射

2.22种X线照射模式对SPC-A1细胞CCR7表达的影响8 Gy单次X线照射组与2 Gy·d-1连续照射6 d组(生物学效应等效于8 Gy单次照射组)24 h的CCR7比较差异无统计学意义(P>0.05)；8 Gy单次X线照射组与2 Gy·d-1连续照射6 d组(生物学效益等效于8 Gy单次照射组)48 h的CCR7比较差异无统计学意义(P>0.05)；各剂量组24 h、48 h的CCR7比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 2种X线照射模式对SPC-A1细胞CCR7表达的影响

2.3不同浓度顺铂作用于CNE-2细胞不同时间后CCR7表达的变化不同浓度顺铂作用24 h后，与0 μg·mL-1顺铂组比较，0.032 μg·mL-1顺铂组CCR7的表达无变化(P>0.05)，而0.8 μg·mL-1顺铂组、20 μg·mL-1顺铂组CCR7的表达明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)；0.8 μg·mL-1顺铂组、20 μg·mL-1顺铂组CCR7的表达明显高于0.032 μg·mL-1顺铂组，差异均有统计学意义(P均<0.05)； 20 μg·mL-1顺铂组CCR7的表达明显高于0.8 μg·mL-1顺铂组，差异有统计学意义(P均<0.05)。

不同浓度顺铂作用48 h后，与0 μg·mL-1顺铂组比较，0.032 μg·mL-1顺铂组、0.8 μg·mL-1顺铂组、20 μg·mL-1顺铂组CCR7的表达明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)；0.8 μg·mL-1顺铂组、20 μg·mL-1顺铂组CCR7的表达明显高于0.032 μg·mL-1顺铂组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；20 μg·mL-1顺铂组CCR7的表达明显高于0.8 μg·mL-1顺铂组，差异有统计学意义(P均<0.05)。

0 μg·mL-1顺铂组、0.032 μg·mL-1顺铂组及0.8 μg·mL-1顺铂组CCR7表达48 h较24 h降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。20 μg·mL-1顺铂组CCR7表达48 h与24 h比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 不同浓度顺铂作用于

2.4X线照射、顺铂及同步X线照射+顺铂对CNE2细胞CCR7表达的影响与2 Gy·d-1连续照射6 d组及0.032 μg·mL-1顺铂组比较，0.032 μg·mL-1顺铂+2 Gy组CCR7的表达无明显变化(P均>0.05)。与2 Gy·d-1连续照射6 d组及0.8 μg·mL-1顺铂组比较，0.8 μg·mL-1顺铂+2 Gy组CCR7的表达下降，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与2 Gy·d-1连续照射6 d组及20 μg·mL-1顺铂组比较，20 μg·mL-1顺铂+2 Gy组CCR7的表达下降，差异均有统计学意义(P均<0.05)。0.032 μg·mL-1顺铂+2 Gy组、0.8 μg·mL-1顺铂组+2 Gy组、20 μg·mL-1顺铂+2 Gy组3组CCR7的表达两两比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图6。

图6 X线照射、顺铂及同步X线

3 讨论

趋化因子受体是一种G-偶联蛋白，其在许多类型的细胞上表达，已发现超过50种人类趋化因子[6]。趋化因子受体与其相应配体结合参与多种各种生理和病理过程[7]。研究[8-9]发现，在引导肿瘤细胞特异性转移至特定的淋巴结和器官过程中，趋化因子及其受体组成的信号转导通路发挥重要作用。CCR7/CCL21轴主要引导肿瘤细胞淋巴结转移[2,10,11-16]。

趋化因子受体参与恶性肿瘤细胞的生物学行为。然而，一些文献[17-20]报道，受到亚致死性X线照射时，恶性肿瘤细胞转移能力可能增加。1949年，Kaplan等[21]首先报道放疗可能增加患者远处转移机率，1970年Suit等[22]也发现，原发部位复发肿瘤患者接受治疗后转移率较高。本文主要探讨X线照射与SW480细胞、SPC-A1细胞、CNE-2细胞CCR7表达的关系及X线照射、顺铂及同步X线照射+顺铂对CNE-2细胞CCR7表达的影响。

结直肠癌是最常见的消化道肿瘤，其常见转移途径是淋巴系统转移，在某些器官和组织中其趋化因子及其受体的表达特异性增加。从免疫组化图上(SW480细胞)可以看出，趋化因子受体在细胞浆内少量表达，主要表达于细胞膜上。实验结果显示(如图2)，在照射剂量等于或小于10 Gy时，照射24小时后，随着照射剂量的增加，CCR7的表达增加；20 Gy组中CCR7的表达与10 Gy组比较没有进一步增加; 48 h后，2 Gy，10 Gy和20 Gy组与对照组相比有所增加，但组间差异无统计学意义。实验结果表明，大肠癌SW480细胞CCR7的表达在单剂量小于或等于10 Gy的X射线下增加，但在20 Gy的单剂量下增加的趋势不再明显，这可能与单次大剂量X射线照射对细胞杀伤效应及CCR7基因损伤有关。CCR7与结直肠癌转移相关，X射线照射增加了CCR7的表达，因此，实验结果提示放疗可提高肿瘤的局部控制率，但在低剂量放疗时可能促进肿瘤细胞远处转移，而高剂量放疗时尽管CCR7表达增加，由于射线杀伤作用提高，其转移能力并不一定增强。

肺癌是目前危及人类生命的最常见恶性肿瘤之一，用各种治疗方案提高肺癌控制率势在必行。本研究表明，CCR7在SPC-A1细胞中的表达不随照射时间和剂量而改变，大剂量照射较常规照射CCR7表达无变化，提示SPC-A1细胞中CCR7对X线无应答。因此在放、化疗过程中给予相应的CCR7阻断剂可进一步减少肺癌细胞的远处转移，从而提高治疗效果。

鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，综合治疗失败的主要原因仍为远处转移[23]。顺铂是头颈部肿瘤最常用化疗药物之一，本研究探讨CNE-2细胞CCR7在X线照射、顺铂及同步X线照射+顺铂作用后表达的变化，本实验发现CNE-2细胞在X线照射后CCR7的表达增加，但其表达水平并未随剂量的增加而改变。因此，低剂量照射可能使CNE-2细胞转移能力增加，增加放疗剂量尽管使CCR7增加，但由于X线的杀伤作用，并不一定增强其抑制转移能力。CNE-2细胞CCR7的表达在X线照射、顺铂及同步X线照射+顺铂处理后表达增加，相比单纯顺铂，同步X线照射+顺铂作用后CCR7的表达下降，而相比X线照射变化不明显。因此，我们可以看出，与单纯化疗比较，同步放、化疗可能降低CNE-2细胞转移能力，这与临床研究一致，即同时放、化疗可以减少鼻咽癌转移并提高生存率[24-28]。

本实验仅在蛋白水平了解不同细胞各因素处理后CCR7表达的变化，仍不明确肿瘤细胞真正转移能力，同时本实验在体外进行，X线照射、顺铂、同步X线照射+顺铂对动物CCR7表达和肿瘤细胞转移的影响尚不清楚，因此，有必要通过趋化小室，进一步进行动物实验和人体实验，由于多种分子均涉及肿瘤细胞转移，因此需进一步研究上述研究因素对其他涉及肿瘤转移因素的影响。同时，多种干细胞、血管内皮细胞及免疫细胞均表达趋化因子受体，拮抗趋化因子受体的靶向疗法可能引起多种临床不良反应，因此需进一步研究如何针对趋化因子受体的拮抗治疗。