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miR—1203和HOTAIRrs7958904位点对乳腺癌细胞生长的影响

2018-03-07刘文辉肖坚孙维华

中国医药导报 2018年3期
关键词:共转染突变型荧光素酶

刘文辉+肖坚+孙维华

[摘要] 目的 探討长链非编码RNA HOTAIR多态位点rs7958904的遗传变异与miR-1203的关系及两者在乳腺癌细胞生长中的作用。 方法 分别将HOTAIR rs7958904野生型和突变型克隆进双荧光素酶报告载体和过表达载体,双荧光素酶报告载体分别和miR-1203模拟物共转染细胞,检测荧光素酶的表达。过表达载体、miR-1203模拟物或抑制物单独或共转染乳腺癌细胞,荧光定量PCR检测HOTAIR表达,BrdU检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡,Transwell法检测细胞侵袭。 结果 HOTAIR突变型增强了miR-1203对其的靶向结合;miR-1203可以下调突变型HOTAIR的表达,差异有高度统计学意义(P < 0.01);但对野生型HOTAIR影响不显著(P > 0.05)。野生型HOTAIR明显促进乳腺癌细胞的增殖侵袭和抑制其凋亡,突变型HOTAIR的上述作用明显减弱且可以被miR-1203阻断,差异均有高度统计学意义(P < 0.01);miR-1203具有与HOTAIR相反的作用,抑制miR-1203表达后,突变型HOTAIR具有与野生型HOTAIR类似的效果。 结论 HOTAIR rs7958904的突变型能下调HOTAIR的功能,此作用可能是增加了miR-1203的结合位点导致的。此发现将为lncRNA SNP功能的研究探讨提供新的研究方向。

[关键词] 长链非编码RNA;HOTAIR;乳腺癌;miR-1203;单核苷酸多态性

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2018)01(c)-0008-05

[Abstract] Objective To investigate the association between genetic variation of lncRNA HOTAIR SNP rs7958904 and miR-1203, as well as to explore their roles in the growth of breast cancer (BC) cells. Methods The wild type and mutant HOTAIR SNP rs-7958904 were both cloned into the Dual-Luciferase Reporter Vector and Over-expression vector, respectively. The Dual-Luciferase Reporter Vectors and miR-1203 mimics were co-transfected into the cells, and then the luciferase expression was detected. Furthermore, BC cells were transfected with the overexpression vector and/or miR-1203 mimics/inhibitors. And then, HOTAIR expression was detected by fluorescent quantitative PCR, cell proliferation was assessed by BrdU, cell apoptosis was tested by Annexin V-FITC/PI, and cell invasion was examined by Transwell Assay. Results The binding of miR-1203 and HOTAIR was enhanced by mutant HOTAIR; miR-1203 could down-regulate the expression of mutant HOTAIR (P < 0.01), but such down regulation on wild-type HOTAIR was insignificant (P > 0.05). The wild-type HOTAIR promoted the proliferation and invasion of BC cells significantly but inhibit their apoptosis (P < 0.01); whereas such effect of the mutant HOTAIR declined obviously and could be blocked by miR-1203. miR-1203 had the opposite effect of HOTAIR; when the expression of miR-1203 was inhibited, the mutant HOTAIR exhibited a similar effect as wild-type HOTAIR. Conclusion The mutant HOTAIR rs7958904 can down-regulate the activity of HOTAIR, and such down regulation may probably associated with the increment of miR-1203 binding sites. This finding could provide a new direction for the future study in the function of lncRNA SNPs.

[Key words] lncRNA; HOTAIR; Breast cancer; miR-1203; SNPendprint

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性肿瘤中最常见的一种,其发病率在各种女性恶性肿瘤中居于首位,并且逐年上升[1]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一种无蛋白编码能力的功能性RNA分子,研究表明lncRNA在肿瘤发生发展中发挥重要作用[2]。目前研究发现,同源盒基因转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)在大多数肿瘤中呈现高表达,且在肿瘤中发挥重要作用[3-5]。

LncRNA的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)不单会改变lncRNA的结构和稳定性而影响其表达,也有可能影响miRNA-lncRNA间的相互作用而调控其功能发挥,从而影响个体的肿瘤易感性[6-8]。但目前关于lncRNA SNP与乳腺癌间的关联研究还很少,因此探讨lncRNA SNP在个体乳腺癌易感性中的研究具有重大意义。根据预测,HOTAIR rs7958904位点上的G/C突变可增加miR-1203的结合位点。因此,本研究具体探讨HOTAIR rs7958904位点是否能通过miR-1203而影响乳腺癌细胞的生长及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人乳腺癌MDA-MB-231细胞购自美国ATCC细胞库,用含10%胎牛血清(购自杭州四季青)和双抗的RPMI-1640培养基(购自Gibco公司)置于37℃、5% CO2、飽和湿度培养箱中进行培养,每隔3 d用胰酶消化传代。

1.2 过表达载体构建和转染

HOTAIR野生型过表达载体购自广州复能公司,突变型HOTAIR过表达载体用QuikChangeⅡSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)试剂盒进行。转染前1 d,细胞接种6孔板,接种浓度为1×105个细胞/mL,每孔1 mL;第2天当细胞汇合度达到70%左右时进行转染,质粒转染量为4 μg/孔,步骤参考Lipofectamine 2000(Invitrogen)说明书进行;转染后4~6 h换液,48 h后进行后续实验检测。

1.3 双荧光素酶报告基因检测

HOTAIR野生型和突变型全长序列分别克隆到双荧光素酶报告载体psiCHECK-2(Promega)中,然后分别和miR-1203模拟物(购自广州市锐博生物科技有限公司)共转染细胞。转染48 h后,用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)进行荧光强度测定,用萤火虫荧光素酶为内参进行校正,从而得出相对的荧光强度比,并将数据进行分析。

1.4 荧光定量PCR

收集细胞用Trizol提取总RNA,定量后用1 μg RNA进行逆转录,SYBR-Green染料法(SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO)进行定量PCR,20 μL体系含100 ng cDNA。反应条件为:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,40 cycles。每个样重复3次,定量分析通过比较2-ΔΔCt值进行。

1.5 细胞增殖

用BrdU ELISA kit(Roche)进行检测。细胞接种于96孔板中,转染后继续培养48 h。去除培养基,加入20μL BrdU标记液,继续培养3 h细胞固定后,加入过氧化物酶标记的BrdU抗体孵育90 min。继续加入过氧化物酶底物,在酶标仪上以370 nm/492 nm 双波长检测吸光值,即BrdU掺入量。每组设3个复孔。

1.6 细胞凋亡

转染48 h后收集细胞,按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)说明书操作,加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μL Annexin V-FITC混匀后,再加入5 μL Propidium Iodide,混匀;室温、避光、反应5~15 min,用流式细胞仪进行检测,实验重复3次。

1.7 细胞侵袭

往Transwell小室中铺上Matrigel(BD),细胞转染后第二天进行悬浮,调整细胞密度至1×106个细胞/mL,取200 μL加入Transwell小室上室,在下室加入600 μL完全培养基;37℃、5% CO2孵育48 h后,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗涤1次,结晶紫染色10 min,PBS洗涤1次,拍照计数分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,采用析因设计方差分析比较各组间体外细胞增殖、凋亡及侵袭能力的差异;采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组荧光定量PCR检测结果;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOTAIR SNP rs7958904对miR-1203靶向结合的影响

利用lncRNA SNP在线预测软件分析HOTAIR多态性与miRNA间的匹配关系,结果发现rs7958904 G>C等位基因突变可增加一个新的miR-1203结合位点(图1A)。进一步的双荧光素酶报告基因实验表明(图1B),突变型HOTAIR载体与miR-1203共转染时,荧光素酶表达较NC miRNA转染组明显下调,差异有高度统计学意义(P < 0.01);野生型HOTAIR载体与miR-1203共转染时,荧光素酶表达下调并不显著(P > 0.05)。这说明,G>C等位基因突变可明显增强miR-1203与HOTAIR的结合。

2.2 不同亚型HOTAIR的表达

分别将HOTAIR野生型和突变型过表达载体转染乳腺癌细胞,HOTAIR表达均上调明显(P < 0.01),但突变型HOTAIR转染组上调程度显著低于野生型HOTAIR转染组(P < 0.01,图2A)。上述质粒与miR-1203模拟物共转染时,miR-1203能显著抑制突变型HOTAIR促进HOTAIR表达的作用(P < 0.01),但对野生型HOTAIR的影响并不显著(图2A)。共转染突变型HOTAIR和miR-1203抑制物时,HOTAIR的表达较Control组上调更明显(P < 0.01),与野生型HOTAIR转染组效果相似(图2A)。因此,miR-1203可以靶向调控突变型HOTAIR的表达。endprint

2.3 miR-1203和不同亚型HOTAIR对细胞增殖的影响

单独转染miR-1203模拟物时,乳腺癌细胞增殖明显下调,而野生型和突变型HOTAIR均会促进乳腺癌细胞的增殖,但突变型HOTAIR的促增殖效果明显低于野生型HOTAIR(图2B),以上差异均有高度统计学意义(P < 0.01)。野生型HOTAIR与miR-1203模拟物共转染时,细胞增殖仍呈上调趋势(P < 0.01),略低于野生型HOTAIR转染组(图2B)。突变型HOTAIR与miR-1203模拟物共转染时,细胞增殖变化并不明显(P > 0.05),只是略低于对照组(图2B)。而突变型HOTAIR与miR-1203抑制物共转染时,细胞增殖显著增强(P < 0.01),与野生型HOTAIR转染组相似(图2B)。因此,miR-1203可以靶向调控突变型HOTAIR而影响细胞增殖。

2.4 miR-1203和不同亚型HOTAIR对细胞凋亡的影响

进一步检测细胞凋亡,结果发现,野生型和突变型HOTAIR均能下调乳腺癌细胞的凋亡率;而miR-1203具有相反的作用,能显著促进细胞凋亡(图3),差异均有高度统计学意义(P < 0.01)。miR-1203能抑制突变型HOTAIR的抑凋亡作用(P < 0.01),但对野生型HOTAIR的影响并不显著(图3)。而转染突变型HOTAIR的同时抑制miR-1203表达后,细胞凋亡被抑制(P < 0.01),与野生型HOTAIR转染组类似(图3)。这表明,miR-1203可以通过靶向抑制HOTAIR的表达而影响HOTAIR的功能发挥。

2.5 miR-1203和不同亚型HOTAIR对细胞侵袭的影响

利用Transwell方法检测乳腺癌细胞的侵袭行为,结果见图4。miR-1203能显著抑制乳腺癌细胞的侵袭,而野生型HOTAIR显著促进乳腺癌细胞的侵袭。突变型HOTAIR也具有促进细胞侵袭的作用,但效果明显低于野生型HOTAIR转染组,以上差异均有高度统计学意义(P < 0.01)。共转染野生型HOTAIR与miR-1203模拟物时,细胞侵袭仍然显著增加(P < 0.01);共转染突变型HOTAIR与miR-1203模拟物时,细胞侵袭与对照组比较差无统计学意义(P > 0.05)。但共转染突变型HOTAIR与miR-1203抑制物时,细胞侵袭显著下调(P < 0.01)。因此,miR-1203可以靶向调控突变型HOTAIR表达而抑制细胞侵袭。

3 讨论

随着研究的深入,lncRNA的遗传多态性与个体肿瘤的易感性间存在莫大关联。本研究也表明HOTAIR rs7958904遗传变异会影响HOTAIR功能发挥。Guo等[9]发现,HOTAIR的rs12826786位点发生遗传变异时会影响HOTAIR的转录表达。而Zhang等[10]研究表明rs920778 C→T突变能促进HOTAIR的转录表达。上述研究均表明,lncRNA遗传多态性确实能影响其本身功能发挥,从而在各种肿瘤发生发展中发挥作用。

研究进一步发现,HOTAIR rs7958904突变后会增加miR-1203的结合位点。miR-1203下调突变型HOTAIR的作用,而对野生型HOTAIR影响不明显。当抑制miR-1203表达后,突变型HOTAIR具有与野生型类似的功能。Wu等[11]发现lincRNA-uc003opf.1位点rs11752942的G等位基因能够增加miR-149的结合位点,从而受miR-149的調控而抑制自身的表达,进而影响细胞分化和肿瘤生长。上述研究均说明,lncRNA遗传多态性影响自身功能的一种手段是改变了一些相关miRNAs对自身的调控作用,进而对肿瘤细胞的生长产生影响。本研究同时证明,miR-1203具有抑癌功能,其过表达可以抑制乳腺癌细胞增殖侵袭,而抑制其凋亡。有研究表明,miR-1203在肾细胞癌、胰腺癌和食管鳞癌中表达下调[12-14],并在非小细胞肺癌中呈现甲基化[15]。因此,miR-1203有可能是一种抑癌基因。

综上所述,HOTAIR rs7958904突变会增加抑癌基因miR-1203的结合,从而受miR-1203的调控而影响其功能发挥。这为lncRNA遗传多态性功能变化的研究提供了新思路。

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(收稿日期:2017-10-10 本文編辑:任 念)endprint

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