ICP-MS测定全血中5种微量元素及其参考区间的建立

徐凤仙， 于嘉屏， 吴娟娟

（上海迪安医学检验所研发实验室，上海 200433）

人体内的微量元素含量处于动态平衡中，缺乏和过量都会对人体产生不良影响。人体铁（iron，Fe）、镁（magnesium，Mg）、钙（calcium，Ca）、锌（zinc，Zn）、铜（copper，Cu）元素水平的高低与很多疾病及健康息息相关，如精神分裂[1]、动脉粥样硬化[2]、阿兹海默症[3]、早产风险[4-5]、新生儿健康[6-7]、弗里德赖希共济失调[8]、慢性疾病[9]、抗氧化保护[10]等。如何快速、准确地检测人体微量元素水平，进而推断与疾病的相关性成为临床亟待解决的问题。目前，检测微量元素的方法有原子吸收光谱法（atomic absorption spectroscopy，AAS）[11]、电感耦合等离子体原子发射光谱法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES）[12]、电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[13]等。其中ICP-MS以其线性范围宽、检测敏感性高、可同时测定多种元素、基质效应低等特点受到普遍关注。我们拟建立ICP-MS同时检测全血中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5种元素的方法，探讨ICP-MS用于临床大样本检测的可行性。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

安捷伦7700x电感耦合等离子体质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、BY-400C型医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司）、BSA224SCW型分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）、优普超纯水仪（成都超纯科技有限公司）、快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）、Thermo Scientific可调移液器（美国Thermo公司）等。硝酸（超纯级，苏州晶瑞化学股份有限公司）、Triton 100（美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）。Fe、Mg、Ca、Zn、Cu标准品（可溯源至中国计量科学研究院）及内标品锗（germanium，Ge）由国家有色金属及电子材料分析检测中心提供，浓度均为1 000 μg/mL。1 μg/L调谐液（铈、钴、锂、Mg、铊、钇混合液，美国安捷伦科技有限公司）

1.2 方法

1.2.1 仪器准备 仪器按正常程序开机，抽真空，然后在待机情况下进行仪器维护，点火调谐，性能验证成功后进行批处理调谐。相关工作参数：载气流速为0.35 L/min，气流速为0.61 L/min； 等离子体模式，高基质系统；等离子体气流速为15 L/min；采样深度为10 mm；射频功率为1 550 W；提取透镜为-200 V；Omega透镜电压为11.0 V；Omega偏转电压为-70 V；积分时间为0.1 s；重复次数为3次；蠕动泵流速为0.1 r/min；氦气流速为5 L/min。在批处理调谐相关参数达到分析要求[质量轴±0.1、每秒计数值（counts per second，CPS）＞2 400、氧化物＜1%，双电荷＜3%]后开始正常分析程序。

1.2.2 采样前相关试剂及系统准备 进样分析前分别对系统中可能引起污染的部件，如雾化器、雾化池、炬管及锥进行浸泡清洗，更换管线，每个样本采集结束后分别切换至进样口冲洗、稀硝酸溶液及超纯水清洗，相关试剂均用超纯水稀释至对应浓度后进样检测，考察各个元素的干扰情况。每个批次分析前分别进样超纯水及稀释液，排除空白干扰之后再进行样本分析。

1.2.3 稀释液配制 分别移取2.5 mL硝酸及0.5 mL Triton 100至500 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，然后转移至聚丙稀瓶中，得到含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀释液，储存于4 ℃冰箱中待用。

1.2.4 标准应用液配制 分别移取不同体积的标准品母液，参照全血样本中不同目标元素水平进行配制，分别得到混合标准品母液，其中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu水平分别为500、50、125、12.5、3.125 μg/mL。同样移取适量内标品配制得到0.5 μg/mL 内标液，然后分别移取2.5、5、10、20、40 μL母液，加入20 μL内标液，然后分别定容至1 mL，得到S1、S2、S3、S4、S5 5个浓度，待用。

1.2.5 样本稀释准备 将全血样本充分混匀，然后准确移取20 μL全血样本，加入20 μL内标液，再加入960 μL含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀释液，定容至1 mL，充分混匀，采用蠕动泵连续进样，采集时间为0.1 s。

1.3 方法学评价

1.3.1 线性评价 将混合标准应用液S1～S5按正常程序进行处理并进样分析，观察Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5种元素标准曲线的线性。

1.3.2 基质效应及相关干扰 分别准备2个水平的混合标准品（C1），C1为理论浓度，进样分析得到一个检测值C2。将同样水平的标准品加入全血样本中，检测得到加入量C3，分别进样。平行检测6份样本，计算C1、C2与C3的相对标准偏差，即目标元素在纯稀释液中与在全血基质中结果的差异，评价基质干扰程度。每批标准应用液检测结束之后进样分析空白稀释液，如果采集记数超过最低点计数的20%则继续进行空白稀释液分析，直至残留干扰达到S1点的20%以内。

1.3.3 精密度 分别准备低、中、高水平混合全血样本，进行6次重复处理后进样分析，检测5种元素的水平，观察批内重复性[以变异系数（coefficient of variation，CV）表示]；准备低、中、高水平全血样本，分3批进行6次重复处理（分3 d，每天2批），进样分析，检测5种元素的水平，观察批间重复性（以CV表示）。

1.3.4 添加回收试验 将1份混合全血样本平行测定20次，求得本底值L1，在此基础上添加中水平和高水平标准品得到L2和L3，然后分别检测L2和L3各元素的水平及对应的添加回收率。

1.3.5 室间比对试验 分别准备3个不同水平的全血样本（C1、C2、C3），每个水平进行6次进样检测，将本实验室的测定结果与安捷伦科技（中国）有限公司上海分公司实验室（简称安捷伦实验室）的安捷伦7700x电感耦合等离子体质谱仪的测定结果进行比对，观察不同实验室间结果的差异。

1.3.6 参考区间的建立 选取2016年7月杭州地区体检正常者495名，其中男242名、女253名，年龄2～50岁。按年龄分为≤16岁组（254名）和＞16岁组（241名）。采用肝素钠抗凝真空采血管采集静脉全血样本，充分摇匀，2～8 ℃保存待测，采用ICP-MS检测5种元素，建立正常人群的参考区间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。正态性检验结果显示所有数据均呈正态分布，以x ±s表示，组间比较采用t检验，以x ±2s方式建立参考区间。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性评价及最低定量限（limit of quantitation，LOQ）

以标准点浓度为X，对应元素CPS与内标CPS比率为Y，建立线性回归方程，r值为0.999 6～1.000 0。5种元素线性均良好。见表1。

重复检测超纯水11次，计算标准偏差，以10倍标准偏差作为该法的LOQ，见表1。

2.2 基质效应

相对标准偏差范围为0.7%～6.0%，稀释之后基质对检测结果基本无影响。见表2。

2.3 精密度验证

采用ICP-MS检测低、中、高水平样本，Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的批内CV为0.31%～3.62%，批间CV为1.37%～7.15%。见表3。

2.4 添加回收试验

将L2、L3处理后分别检测6次，求得L2、L3均值，Fe、Mg、Ca、Zn、Cu对应的添加回收率为98.2%～112.7%，符合要求（100%±20%）。见表4。

表1 5种元素线性回归方程及线性范围

表2 5种元素基质效应分析

表3 5种元素批内、批间CV结果 （%）

表4 添加回收试验结果

2.5 室间比对分析

本实验室测定结果与安捷伦实验室的平均相对偏差为0.61%～5.56%，本方法准确度满足要求，可用于大样本分析。见表5。

表5 室间比对分析结果

2.6 临床应用及参考区间统计

男、女性之间5种元素差异均无统计学意义（P＞0.05）。按年龄划分为未成年组（≤16岁）和成年组（＞16岁），成年组与未成年组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。未成年组Cu元素比成年组低1.0%，Ca元素比成年组高8.5%，Mg元素比成年组高4.3%，Fe元素比成人组低2.4%，Zn元素比成年组低24.4%。以x ±2s计算参考区间。见表6、表7。

表6 成年组与未成年组Mg、Ca、Fe、Cu 、Zn结果的比较 （mg/L，x±s）

表7 Mg、Ca、Fe、Cu、Zn的参考区间 （mg/L）

3 讨论

随着人们对营养要求关注的增加，各种食品中或多或少会添加单一元素或复合元素，以补充人体所需的微量元素[14]。本研究结果显示，未成年人Zn水平相对较低，与文献报道[15-16]一致，因此需引起临床重视，但也不可盲目补充，应结合相应检测结果适当地进行控制或补充。

ICP-MS是20世纪80年代发展起来的较新的检测技术，其将ICP的高温电离特性与四极杆质谱的高敏感性相结合，形成一种新型的同位素分析、元素分析和形态分析技术，具有检出线性范围宽、检出限低、干扰因素少、基质效应低、分析精密度高、分析速度快等特性，广泛应用于环境、化工、食品、医学等多个领域。本研究结果显示，ICP-MS检测全血Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的线性关系良好，批内、批间精密度均符合临床检测要求，同时还初步建立了杭州地区未成年人与成年人全血5种元素的参考区间。

综上所述，ICP-MS具有敏感性高、抗干扰能力强、准确度高及稳定性好的优点，可同时检测Fe、Mg、Ca、Zn、Cu元素，而且临床适用性较好，可为临床相关疾病的诊断提供参考依据。

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