由中链脂肪酸与植物精油为主要成分组成的复合型酸化剂抑菌性能的研究

祁姣姣，朱剑锋，周海泳，胡学生，王 创，刘紫芊，胡文锋，*

（1. 生物源生物技术（深圳）股份有限公司，深圳 518118；2.华南农业大学，广州 510642）

抗生素在动物生产应用中长期大量滥用，可造成动物机体免疫力下降[1]，在畜产品和环境中造成残留[2]，甚至导致人畜共患耐药细菌的产生等严重后果，严重地危害着人类健康[3]。2016年7月26日的我国农业部第2428号公告：决定停止硫酸黏菌素用于动物促生长[4]。在饲料中限制甚至禁用抗生素是消费者的要求，是全球大趋势，为适应这一需求，积极开发可替代抗生素的绿色饲料添加剂具有积极的意义。中链脂肪酸（mediumchain fatty acids ， MCFAs）包括己酸（C6）、辛酸（C8）、癸酸（C10）和月桂酸（C12），其在动物体内因其独特的消化、吸收、转运和氧化等特点，能迅速有效地为幼小动物提供能量，具有显著的抗菌和促生长等功效[5]。另外，天然植物精油具有显著的抑菌活性、广谱抗菌性以及安全、易降解等特点。

目前大量学者对肉桂醛、百里香酚、丁香酚、香芹酚等植物精油主要成分的抑菌性能、相互抑菌协同作用以及其抑菌机制进行探究。发现其具有高抑菌活性，但是将其和中链脂肪酸配合作为高效的复合型饲料酸化剂未见报道。为此，本试验以大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种菌为指示菌，利用正交优化实验，得到抑菌性能最优的复合型酸化剂，并对其抑菌性能进行探讨。试验旨在为探究替代抗生素促生长剂的高效的复合型酸化剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂

己酸（C6， 80%）、辛酸（C8， 80%）：河南雅大食品有限公司 ；癸酸（C10， 分析纯）、月桂酸（C12， 分析纯）：成都化夏化学试剂有限公司；肉桂醛（99%）：江西雪松天然药用油有限公司提供；吐温-80：广州化学试剂厂；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；香芹酚（分析纯）：广州日化化工有限公司；百里香酚（分析纯）：吉安市青原区东方天然香料油提炼厂；丁香酚（分析纯）：日本东京化成工业株式会社。

1.1.2 培养基及菌种

指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由华南农业大学食品学院应用微生物教研室提供。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g，氯化钠5 g，加水1 000 mL加热，调节pH至7.0-7.2，分装到三角瓶中。密封，121 ℃，0.1 mpa灭菌20 min。如需配置固体培养基则加入2%琼脂，操作同上。

1.1.3 主要仪器设备

LS-B75C-I立式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；HK-C2S型单人双面垂直洁净工作台，广东环凯微生物科技有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；酶标仪，PE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗菌剂溶液的配制

称取一定量的抗菌剂分别溶于0.5%（v/v）无水乙醇，然后加入含0.5%（w/v）吐温-80的无菌液体，边倒边搅拌，震荡均匀。其中乙醇含量0.5%，吐温-80含量0.5%，在该浓度下，二者通过预实验证明均无抑菌性[6]。

1.2.2 复合型抗菌剂配方的初步筛选

根据李成应等筛选中药制剂的方法，略有改动[7]。按L8（27）正交表(表1)和表2的剂量水平添加配置成相应的8种抗菌剂溶液的母液，调节母液的浓度为2 000 μg/mL。将复配好的8种抗菌剂的母液，分别加入到无菌的96孔聚苯乙烯板中，其中第2至第12孔每孔加入100 μL无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基，第1、2孔加100 μL抗菌剂液，混合均匀，从第2孔中吸取100 μL到第3孔，以此类推，第11孔吸取100 μL弃掉，然后分别在第1到12孔加入100 μL105CFU/mL菌液，此时各孔对应的组合抗菌剂配方的浓度依次为1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.6 μg/mL、7.8 μg/mL、3.9 μg/mL等，将96孔板密封后置37 ℃恒温培养箱中，培养24 h后测定OD600nm值。重复3次，取平均值，选取适当组合抗菌剂配方的浓度所对应的OD600nm值，进行极差分析。同时设置空白对照和抗生素对照。

1.2.3 复合型抗菌剂配方的优化

根据1.2.2的初筛结果，采用正交表L25（56）组合(表3)，进一步做抗菌剂的优化组合探究。各抗菌剂剂量水平设置见表4，方法同1.2.2。培养一定时间，测定OD600nm值。同时设置空白对照和抗生素对照组。重复3次，取平均值，选取适当抗菌剂组合的浓度所对应的OD600nm值，进行极差分析。剂量优化后的最优组合为抗菌基础配方。

1.2.4 复合型抗菌剂最优配方的验证将直观最优组合和正交实验优化的最优组合按表4的剂量水平配置成相应母液，调节母液的浓度为2 000 μg/mL。按照1.2.2方法，进行验证实验。

1.3 复合型酸化剂抑菌性能研究

1.3.1 复合型酸化剂抑菌敏感性测定

采用打孔法。吸取100 μL 107CFU/mL指示菌的菌悬液于营养琼脂培养皿中，涂布均匀。利用8 mm无菌打孔器打孔。然后在每个孔中分别加入100 μL的对应浓度（0.5%）的复合型酸化剂溶液。于37 ℃恒温培养箱，培养24 h，取出，测定其抑菌圈大小。同时做空白对照。

1.3.2 复合型酸化剂最低抑菌浓度（MIC）测定

采用琼脂平板稀释法：将不同剂量的复合型酸化剂液10 mL，加入50 ℃左右的10 mL牛肉膏蛋白胨固体培养基中，震荡均匀，迅速倾倒平板，制成含不同递减浓度的试剂平板。用无菌接种器，接种指示菌，最终每点菌数约为104CFU，形成直径为5～8 mm的菌斑。将平板置于37 ℃恒温培养箱中，培养24 h，观察。以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低样品浓度为MIC。同时做抗生素和阴性对照。实验重复3次

1.3.3 最优复合型酸化剂热稳定性研究

综合考虑正交实验的直观和优化结果分析以及抑菌敏感性、MIC的比较，选定最优复合型酸化剂组合做以下探究。将最优组合分别于60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴，121℃湿热条件下处理15 min后[8]，然后分别再加入100 μL菌液，使最终菌液的浓度为105CFU/mL，试剂的浓度为250 μg/mL。然后置于37 ℃培养箱中培养24 h，测定OD600nm值。同时做不加抗菌剂的阴性对照和空白对照，实验重复3次，观察最优抗菌剂组合在热环境中对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌变化规律。

表1 L8（27）正交表

表2 各抗菌剂量水平设置

表3 L25（56）正交表

1.3.4 最优复合型酸化剂抑菌时效的测定

将最优组合配置成浓度为0.5%的复合液，取100 μL加入到已涂布菌液的平板中的孔内，分别于24、48、72、144、216 h，观察并测定抑菌圈直径。

1.3.5 最优复合型酸化剂在人工模拟胃、肠液环境中抑菌效能评价

1）最优复合型酸化剂在人工模拟胃液环境中的抑菌特性

在人工胃液环境中分别加入最优组合溶液和指示菌液，使指示菌最终浓度是105CFU/mL，最优组合溶液的最终浓度为500 μg/mL，37 ℃，90 r/min[9]处理4 h，然后采用十倍稀释法涂布计数[9]。同时做指示菌纯培养4 h后的活菌计数，然后计算杀菌率。按上述同样操作，测定指示菌在非人工胃液的配方试剂环境中（即pH7.0，用生理盐水配置的最优组合配方液）的杀菌率，并进行比较。

杀菌率的计算公式如下：

2）最优复合型酸化剂在人工模拟肠液环境中的抑菌特性

在人工肠液环境中，分别加入最优组合和指示菌，指示菌最终浓度是105CFU/mL，最优组合溶液的最终浓度为500 μg/mL，37 ℃，120 r/min处理4 h，然后十倍稀释法涂布计数，同时做指示菌纯培养4 h后的活菌数，然后计算杀菌率[9]。同时按上述同样操作，测定在非人工肠液的配方试剂环境中（pH7.0，用生理盐水配置的最优组合配方）指示菌的杀菌率，并进行比较，公式如上所示。

1.3.6 统计与分析

所有实验重复三次，数据结果以平均值（mean）±标准差（SD）表示。数据图、表由Excel2003软件完成。

3 结果与分析

3.1.1 复合型酸化剂配方初步筛选结果

表4 优选因素剂量水平设置

表5 各组合方案抗3种指示菌作用正交实验结果

表6 各组合配方抗3种指示菌正交实验结果

表5可知，抗大肠杆菌的正交实验结果表明，主次因素依次为：肉桂醛＞己酸＞辛酸＞香芹酚＞癸酸＞百里香酚＞丁香酚；抗沙门氏菌的正交实验结果表明，主次因素依次为：肉桂醛＞己酸＞辛酸＞香芹酚＞癸酸＞丁香酚＞百里香酚；抗金黄色葡萄球菌正交实验结果表明，主次因素依次为：肉桂醛＞癸酸＞香芹酚＞丁香酚＞百里香酚＞己酸＞辛酸。

综合考虑，优化组合肉桂醛1、香芹酚1、癸酸1、辛酸1、己酸1、百里香酚2、丁香酚1。即因素肉桂醛、香芹酚、癸酸、辛酸、己酸、丁香酚均取1水平，因素6取2水平。该组合能同时较优地抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

3.1.2 复合型酸化剂配方的确定

由表6可知，对大肠杆菌抑菌的直观分析最优组合号为4、7、8、11、21、22、25；对沙门氏菌抑菌的直观分析最优组合号为8、11、18、22；对金黄色葡萄球菌的直观分析最优组合号为8、21。由表6和表7可知，对大肠杆菌，影响其抑菌作用的主次因素依次为：肉桂醛＞辛酸＞丁香酚＞己酸＞癸酸＞香芹酚。其中肉桂醛对其具有显著性影响（P＜0.05）。最优组合为：2辛酸，1香芹酚，4癸酸，5肉桂醛，（3、4、2）丁香酚，1己酸；对沙门氏菌，影响其抑菌作用的主次因素依次为：肉桂醛＞癸酸＞丁香酚＞香芹酚＞辛酸＞己酸。其中肉桂醛、癸酸、丁香酚对其具有显著性影响（P＜0.05）。最优组合为：3（2、4）辛酸，3（1、2）香芹酚，1（2）癸酸，5肉桂醛，1（2）丁香酚，2（5、1）己酸；对金黄色葡萄球菌，影响其抑菌作用的主次因素依次为：己酸＞肉桂醛＞丁香酚＞癸酸＞香芹酚＞辛酸。其中己酸、肉桂醛、丁香酚对其具有显著性影响（P＜0.05）。最优组合为：4（3、5）辛酸，1香芹酚，5癸酸，5肉桂醛，（2、3、1）丁香酚，2己酸。

以上对表6与表7分析可知，直观分析能同时抗三种指示菌的最优组合号为8，其次为11、22，最后为19。综合分析能同时抗三种指示菌的优化组合为0：2辛酸、1香芹酚、1癸酸、5肉桂醛、2丁香酚、2己酸

表7 各组合配方抗3种指示菌正交实验方差分析

表8 正交验证实验结果

表9 复合型酸化剂对指示菌抑菌圈测定结果

表10 复合型酸化剂对指示菌的MIC

3.1.3 优化配方结果验证

由表8可知，浓度为250 μg/mL时，对沙门氏菌和大肠杆菌，0号组合较8号组合抑制效果好，特别是对沙门氏菌的抑制作用，0号组合明显强。然而在抑制金黄色葡萄球菌时，0号组合较8号组合稍弱。这可能是因为，在选择对三种指示菌同时具有抑制作用的最优组合的因素时，是经过综合评价并优先选择对革兰氏阴性菌具有很好抑制作用的结果。

3.2 复合型酸化剂抑菌性能测定结果

3.2.1 复合型酸化剂抑菌敏感性测定结果

表9可知，这5种组合对3种指示菌均具有不错的抑制效果，在浓度为0.5%时，8号组合对金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大为31.49 mm，其次为0号组合。就大肠杆菌和沙门氏菌而言，0号组合较8号组合更优，其次为8号组合。

3.2.2 复合型酸化剂最低抑菌浓度测定结果

由表10可知：各抑菌组合对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌3种指示菌的MIC。可以发现，正交优化最优组合配方0号和直观最优组合配方8号，以及11、19、22号组合，对3种指示菌的MIC值都明显高于硫酸新霉素、黄霉素的MIC值。即便如此，该组合仍具有一定的现实意义，比如0号组合的抑菌性良好，且由中链脂肪酸和植物精油构成，在兼具抑菌性能的同时，对动物可以产生一定的诱食性，且其安全、无毒。

3.2.3 优化组合复合型酸化剂热稳定性研究结果

如图1所示，随着处理温度的上升，其对3种指示菌的抑菌性能均为先上升后下降。具体为，对于大肠杆菌，在4（60 ℃）其具有最佳抑菌效果；在5（100 ℃）和6（121 ℃）中，随着处理温度的升高，其对大肠杆菌的抑菌效果降低，特别是处理6（121 ℃），相对于1（阴性对照），其经121℃湿热处理后，基本失去对大肠杆菌的抑制作用。对于沙门氏菌，其经3（60 ℃）处理后对沙门氏菌的抑菌效果增加；在4（80 ℃）、5（100 ℃）、6（121 ℃）中，随着处理温度的升高，其对沙门氏菌的抑菌效果降低。对金黄色葡萄球菌，最优组合配方经3（60 ℃）处理后，其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著增加；在4（80 ℃）、5（100 ℃）、6（121 ℃）中，相对于2（常温），随着处理温度的升高，其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果降低。特别是最优组合配方经6（121 ℃）处理后，相对于阴性对照，此时，其对金黄色葡萄球菌几乎无抑制作用。

图1 温度对最优复合型酸化剂抑菌的影响

随着处理温度的升高，最优组合配方对指示菌的抑菌效果先增加，这可能与体系构成的复杂度有关(成分复杂、微乳化环境)，适当加热处理后，体系结构可能发生有利于配方溶液抑制指示菌方向的变化。随后，随着处理温度的继续升高，其对指示菌的抑菌效果降低，甚至是消失，这可能是因为随着进一步的高温处理后，复配液中抗菌剂成分遭到破坏或者挥发。综合最优组合配方随着温度的变化对三种指示菌抑菌的变化规律推测，其经60 ℃密封加热处理，有利于最优组合配方对3种指示菌同时发挥较好的抑菌作用。

3.2.4 最优复合型酸化剂抑菌时间的测定

该最优组合复配液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈在长时间培养中变化不大。分别从24 h测得的27.36 mm变至25.22 mm，17.45 mm变至14.04 mm，16.12 mm变至14.57 mm。其抑菌效果能在较长时间内发挥作用，指示菌不易回长。

3.2.5 最优复合型酸化剂在模拟胃、肠液环境中抑菌效能评价

如表11所示，最优组合配方在模拟胃液环境中对指示菌作用4 h后，仍能将金黄色葡萄球菌和沙门氏菌全部杀死，而其在此环境中对大肠杆菌的抑菌效果有所下降，但是其杀菌率仍能达到95.6%，仍具有较好的抑菌性能。其在人工模拟肠液环境中对指示菌作用4 h后，仍能将金黄色葡萄球菌全部杀死，而其在此环境中对沙门氏菌、大肠杆菌的抑菌能力有所下降，但是其杀菌率仍分别能达到93.8%、98.24%，仍具有较好的抑菌性能。

4 结论

1)通过对样品的筛选，利用正交实验优化，筛选出抑菌剂的最佳优化配比为0号组合，即辛酸∶香芹酚∶癸酸∶肉桂醛∶丁香酚∶己酸=2∶1∶1∶5∶2∶2，直观最优配比组合为8号组合，即辛酸∶香芹酚∶癸酸∶肉桂醛∶丁香酚∶己酸=2∶3∶4∶5∶1∶2。

表11 最优组合配方在人工模拟胃液、人工模拟肠液环境中抑菌效能评价%

2)0号和8号组合对3种指示菌均有很好的抑制作用。最优配方0号组合，随着温度的升高，其抑菌能力先上升后下降。其能在较长时间（216 h）内发挥抑菌作用，指示菌不易回长。其在模拟胃、肠液环境中仍具有很强的抑菌能力，在模拟胃液环境中，其可以100%杀灭金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，对大肠杆菌的杀菌率为95.6%；其在模拟肠液环境中对三者的杀菌率依次为，100%、93.8%、98.24%等。

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