微粒体与冠状动脉粥样硬化的相关性研究进展①

滕小冬 陈月云

(皖南医学院附属弋矶山医院老年医学内科，芜湖 241001)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary heart disease，CHD)是我国居民的首要死亡原因，并且每年诊断为冠心病的患者数量仍在逐年上升。对冠心病的危险因素和心血管事件的风险进行分层，除了相关的临床表现外，血浆生物标志物的表达在冠心病急性事件的高危患者的管理中起主导作用。近年来微粒体(Microparticles，MPs)又称为亚微米囊泡，被认为在动脉粥样硬化斑块的形成和发生发展中起作用，可引起稳定性心绞痛(Stable angina pectoris,SA)或急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)。现对MPs形成、组成和可能的机制及与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病途径及治疗靶点的相关性综述如下：

1 什么是微粒体

微粒体在1967年首次报道时被称为“血小板粉尘”，但目前国内外研究显示MPs已不仅仅是“无辜碎片”，它还具有强促凝血和促炎特性。是衍生自任何真核细胞质膜的亚细胞颗粒(直径<1 μm),是响应各种生物过程如细胞活化和凋亡而形成的，但在ACS、败血症、全身炎症(包括血管炎)和恶性肿瘤等疾病状态中有过量存在。近年来，越来越多的研究探索了MPs的形成机制：包括血管生成、炎症和凝血等机制。MPs 的形成是一个有序的、有选择性的过程，各细胞来源的MPs会带有其母细胞的标志物。血小板来源的 MPs(PMPs)携带有CD42b(GPⅠb)、CD41a以及GPⅡb/Ⅲa 等；内皮细胞来源的 MPs(EMPs)携带有CD105(内皮糖蛋白)、CD144(血管内皮钙黏着蛋白)、CD31(血小板来源生长因子)及CD146等；单核细胞来源的MPs(MMPs)可携带有 PSGL-1/CD162(P-选择素糖蛋白配体1)、CD11b及CD14等。PMPs、MMPs 等还常含有组织因子(Tissue factor，TF)。利用这些细胞标志物有助于识别MPs的细胞来源及其母细胞状态[1]。

循环血液中及斑块中均存在 MPs，但其组成却存在较大差异。血液中的MPs 以血小板来源的为主，大约占总数(29%±7%)，其次为红细胞、白细胞来源的MPs，斑块内 MPs 的浓度为血浆中MPs浓度的200倍以上。动脉粥样硬化斑块中 MPs 主要来自白细胞，包括巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞(8%±1%)，而几乎无血小板来源的MPs[2]。相反，健康血管壁仅含极少量MPs。

1.1MP的形成和组成 正常质膜由磷脂双层组成。磷脂在这个双层中的分布是不对称的，外层由磷脂酰胆碱/鞘磷脂组成，内层由磷脂酰丝氨酸(PS)组成。这种磷脂分布模式处于三种蛋白质的控制之下：内翻酶(Flippase，静息状态激活，保持磷脂酰丝氨酸处于细胞膜内侧)、外翻酶(Floppase，静息状态失活)和乱序酶(Scramblase，静息状态失活)等。细胞活化后增加细胞内钙浓度，导致内翻酶失活，外翻酶及乱序酶激活，并导致磷脂向外层移动，磷脂酰丝氨酸(PS)暴露出促凝作用增强(图1)。重组的质膜脂双层与细胞骨架的不对称性丧失相关，从而导致囊泡形成;这些囊泡通过半胱天冬酶解成MPs[3]。含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶在Rho相关激酶(ROCKⅠ)蛋白切割释放MPs中起促凝作用。凝血酶诱导的内皮细胞囊泡也显示涉及核因子(NF)-κβ信号传导和ROCKⅡ活化。暴露的PS是有效的促凝血剂，它为凝血酶原酶复合物提供了良好的底物[4]。

1.2MPs的生物学功能 MPs的生物学功能取决于它们来源的母细胞。MP脂质和蛋白质的组成也会根据母细胞类型和触发它们形成的刺激因素而变化[5]。它们在炎症、凝血、内皮功能障碍和血管痉挛中具有广泛的作用，在微血管功能障碍中也起重要作用。MPs的抗凝潜能很大程度是次要的，在PS暴露的作用下，它可作为促凝血因子与组织因子(TF)表达结合的平台[4]。有研究报道MPs也是携带细胞因子、mRNA和病毒的传递者或信使。此外，在心血管疾病中MPs还作为特定的miRNA的转运蛋白。MPs具有抗凝和纤维蛋白溶解功能[4,6]。与母细胞相比MPs还含有增加氧化磷脂和半胱天冬酶的浓度的作用，因此MPs在处理细胞废物过程中起作用[7]。

图1 细胞活化和凋亡导致微粒体的形成Fig.1 Cellular activation and apoptosis leading to microparticle formation

1.3MPs的量化和表型 虽然有多种方法可用于量化MPs，流式细胞术(FC)仍然是最常用的方法[8]。与结合PS的荧光素缀合的膜联蛋白V(AnV)染色通常用于鉴定混合细胞来源的MP[9]。然而一些MPs不与AnV结合，这是否是低PS含量的反映和/或使用AnV染色鉴定所有MPs的技术的限制;或者这些AnV阴性MPs是否真的存在并且具有其他功能还有待研究。由于MPs携带母细胞蛋白和受体，针对这些组分的荧光染料缀合的抗体允许我们使用流式细胞术定量MPs的特定类型。MPs的促凝血功能可以在体外通过凝血酶生成测定(TGA)来证实[10]。

2 MPs在冠状动脉粥样硬化发生中的作用

2.1MPs与血管生成 易损斑块具有如增加坏死、增加巨噬细胞凋亡和血管充血的核心特征[11]。动脉粥样硬化斑块随着生长而发展出自身的微循环，此过程由血管生成因子如血管内皮生长因子(VEGF)驱动[12]。这些微血管为白细胞和红细胞的进入和离开动脉粥样硬化斑块提供了一种供应氧气和营养物质的途径，从而促进斑块的生长。这些微血管不稳定，容易破裂导致斑块内出血[13]。MPs可以在这种血管生成相关的斑块不稳定中起促进作用。

2.2MPs与炎症和凝血 MPs通过多种机制参与炎症介导的损伤。体外研究显示MPs与内皮细胞结合诱导促炎分子的表达。血小板来源的MPs(PMPs)和内皮细胞来源的MPs(EMPs)诱导促炎间质细胞黏附分子-1(ICAM-1)的表达，而单核细胞来源的MPs(MMPs)诱导ICAM-1和白细胞介素(IL-8)的表达[14]。炎症和凝血是许多疾病中的病理过程，TF是凝血因子Ⅶ/Ⅶa的受体，能激活Ⅹ因子及Ⅸ因子，催化凝血反应。研究表明，斑块内来源于单核-巨噬细胞、 淋巴细胞的MPs可能是血管外TF的来源之一。TF二聚体在此时转变为TF单体，其大分子底物结合位点暴露，从而可与Ⅸ因子、Ⅹ因子结合，发挥促凝作用[15]。一旦 TF达到阈浓度，就可与Ⅶ因子形成复合物，启动凝血，促进血栓的继续增长。这是MPs参与纤维性血栓形成的主要途径。

2.3MPs与内皮细胞损伤及微血管功能障碍 血管内皮在调节血管张力和维持血管稳态方面起着非常重要的作用。内皮功能障碍是动脉粥样硬化发展的早期步骤之一。MPs既是内皮细胞活化与凋亡的标志，本身还参与了促进内皮细胞损伤、活化的过程[16]，同时MPs还与斑块进展和动脉粥样硬化血栓形成事件有关。

高达30%的患者在接受经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention，PCI)时心肌没有达到足够的再灌注，这种“无复流”现象可能与微血管阻塞(MVO)有关[17]。Porto等[18]通过将心肌梗死血溶栓治疗(TIMI)血流分级、血栓评分、校正TIMI帧计数、心肌灌注呈色分级、定量呈色评估者评分等指标与PMP、EMP和MVO或微血管密度(MvD)相关联，并研究了78例 ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者PCI治疗后的90 min ST段分辨率。首次提出了MP在MVO发病机制中作用的研究，但与MvD绝对指数的相关性如微血管指数电阻(IMR)尚不明确。

2.4MPs与冠心病的高危因素 血脂异常、吸烟、高血压和糖尿病是冠心病的主要危险因素。在来自Framingham子代队列的844个个体的大型社区基础研究中，EMPs表型与传统的冠心病危险因素作用一致。多变量分析显示高血压和代谢综合征与CD144+EMP相关，高三酰甘油血症与CD144+、CD31+/CD41-EMP相关[18]。通过检测暴露于吸烟的健康志愿者血液中MPs的急性释放，显示吸烟对脉管系统有明显影响[19]。Saudes等[20]已经在他们的横断面研究中证实家族性高胆固醇血症中的MPs浓度和表型与对照组显著不同。家族性高胆固醇血症的动脉粥样硬化斑块患者中AnV+总数、CD45+-泛白细胞和CD45+/CD3+淋巴细胞来源的循环MPs水平显著高于纤维斑块，表明即使在目前最充分的调脂治疗下，低密度脂蛋白暴露的患者具有较高的内皮活化和更高的促炎症特征，这表明血管损伤具有长期作用。Augustine等[21]针对在多巴酚丁胺负荷超声心动图(DSE)诱导性缺血的患者队列中进行了一组MPs测定，发现促凝血剂、血小板、红细胞和内皮衍生的MPs在标准化DSE后立即升高，1 h后降低。在25名阳性DSE检查的患者中，MPs水平应激期间没有明显改变。在DSE测试的患者中也有类似的发现，但与之前的血管疾病有关，随后对这些患者进行冠状动脉造影，DSE期间的MPs升高仅发生在具有正常冠状动脉的患者中，这表明在患有或处于血管疾病风险中的患者MPs显示钝性反应[21]。绝经后健康女性行冠状动脉CT扫描检查在Framingham评分中为低风险，冠状动脉钙化(CAC)评分高的女性EMPs、PMPs及其TGA最高，因此表明他们在鉴定早发冠心病中具有较大的价值。通过招募300例在前三个月具有中风史的患者，以流式细胞术(FCM)测定其EMP，所完成研究的298例受试者中，有29名患者(9.7%)发生了主要的心血管事件，表明具有较高表达的CD62E+MP的患者心血管疾病风险明显升高[21]。Sinning等[22]通过对200例稳定的冠心病患者进行血管造影与心血管结果相关CD31+/AnV+MPs的研究，中位随访6.1年，主要不良心脑血管事件发生了72例(37%)，与未发生任何心脑血管事件的对照组相比，经历心脑血管事件的试验组中的MPs水平显著升高，多变量分析显示高MPs水平与心血管死亡风险相关。这项研究通过将MPs纳入现有风险评分模型，将c统计量(ROC曲线下面积)从0.637增加到0.702，为循环CD31+/膜联蛋白V+MPs作为稳定型冠心病患者心血管事件的独立预测因子提供了有力证据，可用于风险分层。

2.5MPs与ACS Namba等[23]发现ACS患者的PMPs明显高于SA组患者，通过血管内超声(IVUS)记录冠状动脉钙化弧和循环PMPs水平之间呈正相关，具有高负荷的循环PMPs的受试者队列具有较低的无病生存率，表明循环中PMPs含量高低在危险分层中具有潜在作用。Biasucci等[24]研究急性心肌梗死患者PCI后与其外周循环血液相比，冠状动脉内血液中的EMPs和PMPs水平更高。 Min等[25]继续研究出PCI后MPs水平显著降低，提示其在血栓形成中的作用。由此证明循环PMPs与未来动脉粥样硬化血栓形成事件的风险相关。

3 MPs与CHD的治疗与预后

目前正在探索各种治疗方法对调节心血管疾病中MPs的循环水平的作用，这些治疗方式包括饮食替代品、药物治疗和血液滤过，例如在心肌梗死后用n-3脂肪酸治疗似乎对PMPs、MMPs及其促凝血活性的水平产生有利的影响，与安慰剂组相比，n-3脂肪酸组中总MP、组织因子促凝血活性也有所降低。膳食黄烷醇和丰富的燕麦饮食也出现类似的结果，通过服用维生素C抗氧化应激可减少MPs水平。阿司匹林在100 mg/d的剂量维持8周显示PMPs和EMPs的数量分别减少62.7%和28.4%[26]。涉及脂质代谢治疗的研究在减轻MPs的水平方面没有显示出很大的希望。在一组冠心病患者使用辛伐他汀/依泽替米贝组合的患者队列中，没有改变血小板聚集或循环EMPs和PMPs的量[27]。但Huang等[26]表明与较低剂量的阿托伐他汀(10 mg)组相比，高剂量阿托伐他汀(40 mg)的EMP水平降低。PCI的STEMI患者与未接受阿昔单抗组相比，在PCI之前给予阿昔单抗(有效血小板组Ⅱb/Ⅲa抑制剂)组的外周凝血剂MPs水平显著降低。Abdelhafeez等[28]在体外研究中已经得出标准连续静脉血液滤过(CVVH)模型可以降低EMPs水平。从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生的MPs通过标准CVVH过滤器(孔径200 μm，流速250 ml/h)循环70 min，在前30 min内观察到EMPs减少50%。在早期的研究中，Hong等[29]证明通过标准治疗尺寸过滤器过滤不仅去除NMPs，而且消除了一组具有血管炎的儿童的促炎效应。最近，Van Craenenbroeck[30]研究显示基线EMPs与有氧运动训练后峰值氧消耗增加的幅度之间的反比关系，表明EMPs可以增加对有氧能力和内皮功能的预测。

4 存在的问题与展望

目前针对MPs大规模随机试验数据缺乏标准化的量化方法。而从血液收集到离心和储存到分析量化MPs的每个方面都需要标准化。并且PCI的问题之一是由于再狭窄(ISR)的后续临床事件，未考虑再狭窄的因素对MPS的影响。需要探讨在传统CHD风险评分系统中并入绝对水平的MPs以增强患有心脏事件的个体的可预测性。通过使用辅助成像(例如具有MPs的光学相干断层扫描)来关联全局动脉粥样硬化斑块负荷可以对MPs作为潜在生物标志物的效用提出一些思路。将MPs与IMR的促凝血功能相关联，可帮助制定具体的针对性治疗。此外，通过明确MPs与动脉粥样硬化相关的变化(例如动脉粥样硬化的发生)。本身的MPs的作用确认将有助于解决关于CHD中MPs的存在是否仅仅是一个偶然现象以进一步确认MPS的作用。通过蛋白质组学的研究，确立CHD中MPs的主要作用，使之成为并作为预后的生物标志物，同时将定量和功能测定的方法进行标准化，并将注意力转向确定的治疗靶标的开发，同时开发针对MPs的新的抑制剂分子并在临床应用中测试其效果可能较有意义。

5 结论

MPs是细胞活化、凋亡过程中形成的微小颗粒，参与了动脉粥样硬化斑块的形成及破裂、凝血的启动以及血栓的形成，对冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗具有靶向作用。尽管强有力的证据表明MPs是CHD发生和进展中的重要生物学介质，但缺乏检测手段和鉴定的标准化方法就限制了它们在常规临床实践中的应用。显而易见的是，MPs不仅涉及疾病的发病机制，而且它们可以作为预测急性事件的生物标志物，并且可能代表系统信号，可以帮助识别易患动脉粥样硬化斑块的患者。然而，MPs特异性靶向治疗是否是降低心血管病态和死亡率的有效方法尚不能明确，但它进一步加强了我们对冠心病发病机制及治疗途径的认识。

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