定坤丹对PCOS模型大鼠TGF-β1、CTGF和AR表达的影响①

陈 兰 谈 勇 陈淑萍

(南京中医药大学，南京 210046)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是导致内分泌失调和无排卵性不孕的主要原因之一[1]。PCOS以慢性无排卵、高雄激素血症(Hyperandrogenism，HA)、多囊卵巢形态(Polycystic ovary morphology，PCOM)和胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)为特征，严重影响育龄妇女的生育功能，已经成为女性不孕最常见的原因，并与妊娠并发症(妊娠期糖尿病、先兆子痫和巨大儿)相关[2-5]。

卵巢包膜增厚、间质增生纤维化是导致PCOS患者卵泡发育障碍或排卵受阻的重要病理生理原因之一，而卵巢间质增生纤维化以卵巢成纤维细胞过度增殖和细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)沉积为特征。转化生长因子β1(Transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)与结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)参与ECM的产生及积聚过程，促进卵巢纤维化，从而导致卵巢功能下降[6]。Caldwell等[7]研究发现，神经元特异性雄激素受体(Androgen receptor，AR)信号传导功能失调通过抑制窦卵泡发育导致排卵障碍，形成典型的PCOM。因此，其认为针对AR驱动机制的研究是治疗PCOS的新方向。本实验旨在探讨PCOS模型大鼠的卵巢组织中是否存在TGF-β1、CTGF和AR表达的改变，并应用定坤丹进行治疗，分析其对PCOS模型大鼠的卵巢组织中TGF-β1、CTGF和AR表达的影响，以期为定坤丹治疗PCOS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 21日龄健康雌性SD大鼠50只，体重40～60 g，清洁级，购自南京中医药大学实验动物中心，动物合格证号为SCXK(浙)2014-0001，动物自由饮水和摄食，室温控制(22±2)℃，湿度为50%～70%，昼夜各12 h。

1.1.2药品 定坤丹(红参、鹿茸、西红花、三七、白芍、熟地黄、当归、白术、枸杞子、黄芩、香附、茺蔚子、川芎、鹿角霜、阿胶、延胡索)，山西广誉远国药有限公司生产，批准文号：国药准字Z14020656，10.8 g/丸；脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)，美国Sigma；注射用大豆油，浙江田雨山药用油有限公司。

1.1.3主要试剂及仪器 酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(Elabscience)；TGF-β1抗体(Cell Signaling 3711)、CTGF抗体(Abcam ab6992)、AR抗体(Abcam ab52615)；Trizol(美国 Invitrogen)；PCR试剂盒(日本 TaKaRa)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天 P0012S)；Eppendorf Mastercycler nexus PCR仪及台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；ABI 7500型Real-time PCR仪(美国Applied Biosystems)；垂直电泳槽及电泳仪(美国Bio-Rad)；TS-1000脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司)；曝光机(Lu minescent image analyzer IMAGEQUANT LAS 4 000 MINI)。

1.2方法

1.2.1模型制备与分组 50只21日龄SPF级雌性SD大鼠，按随机数字表分为正常组10只，造模组40只，参照Sun等[8]方法制作PCOS大鼠模型，适应性喂养2 d，至23日龄颈背部皮下注射DHEA[6 mg/(100 g·d)]加0.2 ml注射用大豆油，连续注射20 d，正常组同期皮下注射大豆油0.2 ml。自42 d龄起，连续行10 d阴道涂片，观察动情周期，当造模组大鼠失去完整动情周期，即阴道涂片观察到持续角化的阴道上皮细胞，提示造模成功[9]。将造模组大鼠按随机数字表分为模型组、定坤丹高、中、低剂量组各10只。

1.2.2治疗方法 根据《人和动物体表面积折算的等效剂量比率表》计算，定坤丹高、中、低组给药剂量分别为4.5、2.25、1.125 g/kg，相当于临床剂量的2、1、1/2倍。同期正常组和模型组给予蒸馏水。各组大鼠连续灌胃14 d。

1.2.3激素水平测定 腹主动脉采血，13 000 r/min离心20 min，分离血清标本置-20℃冰箱保存，按ELISA试剂盒说明书检测雌二醇(Estradiol，E2)、黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)、睾酮(Testosterone，T)。

1.2.4免疫组织化学 PBS 2×5 min，3%H2O2室温封闭10 min，蒸馏水洗1次，抗原修复，PBS 5 min，一抗4℃过夜。PBS 2×5 min，辣根酶标记链霉菌抗生物素，37℃ 20 min，PBS 2×5 min，DAB显色。显微镜下观察3～10 min，阳性显色为棕色。蒸馏水充分冲洗、复染、封片。Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析结果。

1.2.5实时荧光定量PCR(Real time Quantitative PCR，RT-PCR)检测TGF-β1、CTGF和AR mRNA表达 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(详见表1)。按RNA Trizol试剂盒说明书提取总RNA，反转录为cDNA。反应体系：20 μl，SYBR Green PCR master mix(Roche)10 μl，cDNA 2 μl，正反引物各0.8 μl，无菌水补足20 μl。程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用2-ΔΔCt方法分析结果。

表1RT-PCR目的基因引物序列

Tab.1PrimersequenceofRT-PCRtargetgene

PrimerPrimersequence(5′⁃3′)Length(bp)GeneTGF⁃β1CAAACCCAGGTCTTCATGCT186XM＿017599383 1GTAAGCGCCATCCTCTTTGGCTGFTTACCAATGACAATACCTT120NM＿022266 22TTTGCCCTTCTTAATGTTARAGCAGGGCAGATCCTGTCTA117NM＿012502 1ATCCTGCCTCCTCGTCTCTTβ⁃actinTGTCACCAACTGGGACGATA150NM＿031144GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

1.2.6Western blot检测TGF-β1、CTGF和AR蛋白表达 大鼠卵巢组织提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳(S1：100 V 15 min，S2：120 V 100 min)，湿转(95 V 75 min)至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4℃摇床孵育过夜，一抗稀释液(TGF-β1 1∶2 000；CTGF 1∶2 000；AR 1∶2 000)，二抗室温孵育2 h，二抗稀释液(1∶5 000)。洗膜后用ECL显像曝光。应用Image J软件分析条带积分吸光度值，β-actin作为内参。

2 结果

2.1激素水平 模型组E2、LH及T较正常组显著升高(P<0.01)，而FSH则显著下降(P<0.01)。定坤丹高、低剂量组E2、LH及T显著下降(P<0.01)，而FSH升高(P<0.05)。定坤丹中剂量组E2、LH及T显著下降(P<0.01)，而FSH显著升高(P<0.01)。详见表2。

2.2免疫组化结果 模型组TGF-β1、CTGF和AR的表达较正常组显著升高(P<0.01)。定坤丹高剂量组TGF-β1、CTGF和AR的表达较模型组下降(P<0.01、P<0.05、P<0.01)，中、低剂量组TGF-β1、CTGF和AR的表达较模型组显著下降(P<0.01)，详见表3及图1～3。

2.3RT-PCR结果 模型组TGF-β1、CTGF和AR mRNA的表达较正常组显著升高(P<0.01)；定坤丹高剂量组TGF-β1、CTGF和AR mRNA的表达较模型组下降(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；定坤丹中、低剂量组TGF-β1、CTGF和AR mRNA的表达较模型组显著下降(P<0.01)，详见表4。

2.4Western blot结果 模型组TGF-β1、CTGF和AR的表达较正常组显著升高(P<0.01)。定坤丹高、中、低剂量组TGF-β1、CTGF和AR蛋白表达较模型组显著下降(P<0.01)，详见图4和表5。

GroupsDose(g/kg)E2(pg/ml)LH(mU/ml)FSH(ng/ml)T(ng/ml)Normal-559 39±75 482)33 61±10 472)5 59±2 932)0 81±0 292)Model-717 15±97 46266 73±150 672 22±0 901 68±0 39High4 5624 70±35 872)111 88±58 492)4 77±1 181)1 31±0 232)Medium2 25579 33±98 572)39 25±9 132)5 01±3 382)1 23±0 212)Low1 125616 45±39 881)81 26±38 522)4 85±1 241)1 29±0 222)

Note：Compared with the model group,1)P<0.05，2)P<0.01.

GroupsDose(g/kg)TGF⁃β1CTGFARNormal-0 61±0 022)0 61±0 032)0 60±0 022)Model-0 70±0 020 71±0 020 79±0 01High4 50 66±0 022)0 69±0 011)0 71±0 022)Medium2 250 62±0 012)0 62±0 022)0 65±0 022)Low1 1250 63±0 012)0 65±0 022)0 66±0 022)

Note：Compared with the model group,1)P<0.05,2)P<0.01.

图1 卵巢组织TGF-β1蛋白的免疫组织化学染色结果(×200)Fig.1 Immunohistochemical staining results of TGF-β1 protein in ovarian tissue(×200)

图2 卵巢组织CTGF蛋白的免疫组织化学染色结果(×200)Fig.2 Immunohistochemical staining results of CTGF protein in ovarian tissue(×200)

GroupsDose(g/kg)TGF⁃β1CTGFARNormal-1 57±0 692)2 26±0 642)0 27±0 012)Model-9 78±0 8320 78±1 381 97±0 58High4 56 44±1 451)10 28±4 042)0 96±0 292)Medium2 253 38±0 682)6 88±3 102)0 43±0 082)Low1 1254 51±2 382)8 44±4 912)0 60±0 212)

Note：Compared with the model group,1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsDose(g/kg)TGF⁃β1CTGFARNormal-0 49±0 111)0 62±0 061)0 38±0 051)Model-1 07±0 151 16±0 130 87±0 13High4 50 73±0 111)0 90±0 121)0 67±0 071)Medium2 250 56±0 101)0 74±0 151)0 48±0 061)Low1 1250 64±0 101)0 80±0 171)0 53±0 091)

Note：Compared with the model group,1)P<0.01.

图3 卵巢组织AR蛋白的免疫组织化学染色结果(×200)Fig.3 Immunohistochemical staining results of AR protein in ovarian tissue(×200)

图4 各组大鼠卵巢组织中TGF-β1、CTGF和AR的表达情况Fig.4 Expression of TGF-β1,CTGF and AR in ovarian tissue of rats in each group

3 讨论

虽然目前对于PCOS的发病机制有许多假设，但是未发现特定的基因在PCOS的发病机制中发挥作用，Roh等[10]通过对120名韩国妇女的研究发现TGF-β1基因多态性与PCOS的发展相关。Lee等[11]研究发现通过减少TGF-β1的表达可以防止DHEA诱导的HA的发展，对PCOS有预防和治疗作用。Lu等[12]通过降低CTGF mRNA的表达促进小鼠卵泡生长，从而提高小鼠的妊娠率。Ujvari等[13]的研究表明，CTGF过度表达可能与IR相关，而IR是PCOS的重要特征之一。李晓红等[14]研究亦发现PCOS模型大鼠血清胰岛素水平升高。Pinola等[15]对1 975名妇女研究发现HA不利于PCOS患者的代谢，同时HA将导致PCOS患者卵泡颗粒细胞功能障碍[16]。

定坤丹始于清代乾隆年间(1739年)，虽有几百年的历史，但有关研究在最近几十年才逐渐增多[17]。李启佳等[18]应用红外热成像技术发现定坤丹靶向药效集中在生殖相关区域。宋玉荣等[19]研究发现定坤丹对于多囊卵巢模型大鼠有促排卵作用，其机制可能通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴，降低黄体生成素及睾酮，升高卵泡刺激素，抑制卵巢血管内皮生长因子表达，抑制卵巢新生血管形成，改善卵巢血流，提高卵泡质量，促进卵巢排卵。易星星等[20]研究发现定坤丹与戊酸雌二醇均可使患者子宫内膜增厚，但在增加月经量、改善临床症状及总疗效方面，定坤丹更具优势。

2016年Hum Reprod Update提出的PCOS管理共识指出[21]：克罗米芬(Clomiphene citrate，CC)是PCOS促排卵的一线药物。而目前国内常规运用达英-35治疗PCOS患者的HA[22]。但至今尚无同时治疗PCOS排卵障碍及HA的药物。而且虽然CC是PCOS的一线治疗用药，但是大约15%～40%PCOS患者对CC抵抗[23]。本研究发现DHEA诱导的PCOS模型大鼠卵巢组织中TGF-β1、CTGF和AR表达较正常组明显升高，经定坤丹高、中、低剂量干预治疗后TGF-β1、CTGF和AR表达明显下降，提示定坤丹对PCOS的排卵障碍有一定的预防和治疗作用，并能同时治疗HA，其机制可能是通过调节卵巢组织中TGF-β1、CTGF和AR的表达水平。

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