枸杞多糖对免疫抑制小鼠红细胞免疫功能的影响①

黄振华 邓向亮 张凯敏 赖柳婷 胡明华 马方励 罗 霞 周 联

(广州中医药大学中药学院中医药免疫研究室,广州 510006)

研究表明枸杞多糖具有多种生物学活性，其中包括免疫调节和抗肿瘤活性，并且抗肿瘤活性与增强荷瘤机体免疫功能存在密切联系[1-3]。目前枸杞多糖对免疫系统中NK细胞、巨噬细胞、淋巴细胞功能的调节作用已有大量文献报道，但是对红细胞免疫功能的影响研究较少。1981年Siegel等[4]首次提出红细胞免疫系统的概念，并引起人们重视，其中红细胞免疫与肿瘤发生发展的关系成为研究的热点。红细胞免疫作为免疫系统的重要组成部分，参与机体抗肿瘤免疫应答，主要机制包括红细胞可以通过其表面的补体受体黏附肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞迁移和促进机体清除肿瘤细胞[5]；红细胞通过分泌自然杀伤细胞增强因子(Natural killer enhancing factor,NKEF)增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性[6,7]。事实上，临床研究和动物实验均表明红细胞免疫功能与肿瘤预后相关，荷瘤机体普遍存在红细胞免疫功能低下的现象[8-10]，另外肿瘤患者接受化疗后红细胞免疫功能远低于正常人群[11,12]。因此，改善荷瘤机体红细胞免疫功能可有助于提高肿瘤的治疗效果。研究发现枸杞多糖可以提高免疫抑制小鼠红细胞免疫黏附功能[13]，提示枸杞多糖具有提高机体红细胞免疫功能的潜能，但目前仍缺乏系统性研究。本研究以阿霉素化疗小鼠为模型，探讨枸杞多糖对小鼠红细胞免疫功能的影响，以进一步丰富枸杞多糖免疫调节作用的内涵，并为其开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与细胞 无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)级雄性BALB/c小鼠30只，体质量22～26 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。所用实验动物饲养于广州中医药大学医学实验动物中心SPF级环境。所用肿瘤细胞株为H22小鼠肝癌细胞，本实验室保存。

1.1.2主要试剂 枸杞多糖从宁夏枸杞子中通过水提醇纯法分离提取，并根据分子筛原理分离得到分子量40～350 kD的多糖片段(批号：T20121101-3)；肝素钠注射液为成都市海通药业有限公司生产，批号16020；注射用盐酸多柔比星(即阿霉素)为深圳万乐药业有限公司生产；小鼠流式抗体 PE Anti-mouse CD59a由美国Biolegend公司生产；SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒、Western blot BeyoECL Star 超敏发光液、考马斯亮蓝G-250均购自上海碧云天生物技术有限公司； Anti-NKEF-A antibody、Anti-NKEF-B antibody购自BBI Life Sciences。

1.1.3主要仪器 MCO-20AIC型CO2培养箱为日本SANYO公司生产；BC-2800Vet型兽用血细胞分类计数仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；L535R台式冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司生产；D3024R超高速离心机，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司生产；FACS CantoTMⅡ流式细胞仪为美国BD 公司生产；PowerPacTMHC型Western blot电泳仪为Bio-Rad公司产品。

1.2方法

1.2.1动物造模与给药 小鼠分为正常组、模型组和枸杞多糖250、125和62.5 mg/kg三个剂量组，每组6只。实验第1天，除正常组外，其他组小鼠腹腔注射阿霉素(5 mg/kg)一次，随后立即灌胃给药，其中正常组和模型组小鼠给予生理盐水，枸杞多糖各剂量组给予多糖溶液，1次/d，连续7 d。

1.2.2检测红细胞膜CD59表达水平 小鼠摘眼球取血至肝素钠抗凝管，取抗凝血50 μl按文献[14]报道方法进行预处理并用CD59流式抗体进行标记，采用流式细胞术检测红细胞CD59表达水平。

1.2.3检测红细胞膜带3(Band-3)蛋白水平 参照文献方法[15]提取红细胞膜并进行电泳分离蛋白，以考马斯亮蓝染色后将凝胶置于凝胶成像系统中拍照，进行Band-3含量分析，同时以β-actin作为参照。

1.2.4检测红细胞NKEF-A、NKEF-B蛋白含量 按蛋白提取试剂盒说明方法提取红细胞胞浆蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒对样品蛋白含量进行测定。蛋白样品按Western blot检测方法进行处理，然后检测NKEF-A、NKEF-B表达水平。

1.2.5检测NK细胞杀伤活性 无菌条件下取小鼠脾脏制备细胞悬液。将小鼠脾细胞和CFSE标记的小鼠H22肝癌细胞共孵育24 h。收集细胞后加入磷酸盐缓冲液离心(300×g，5 min)洗涤2次；弃上清，加入碘化丙啶(Propidium iodide，PI)标记，采用流式细胞术检测PI阳性的H22细胞比例。

2 结果

2.1对红细胞膜CD59分子表达的影响 结果如表1所示，与正常组比较，模型组小鼠红细胞CD59表达水平有所升高，但两者之间差异未见统计学意义。枸杞多糖各剂量组红细胞CD59表达水平较模型组有所下降，但差异无统计学意义。

2.2对红细胞Band-3表达的影响 模型组的Band-3含量较正常组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，枸杞多糖125 mg/kg和250 mg/kg剂量组Band-3含量均有明显恢复，差异具有统计学意义(P<0.05)；枸杞多糖各剂量组Band-3含量与正常组比较差异无统计学意义。结果见图1所示。

GroupsDose(mg/kg)nCD59expression(%)Normalcontrol-684 9±2 3Model-688 4±3 8LBP62 5684 5±2 7125685 6±2 2250685 1±1 9

图1 枸杞多糖对小鼠红细胞膜Band-3蛋白表达的影响Fig.1 Effect of Lycium Barbarum polysaccharides on Band-3 level of erythrocytes in miceNote: 1.Normal control group;2.Model group;3.LBP 62.5 mg/kg group;4.LBP 125 mg/kg group;5.LBP 250 mg/kg group.Compared with group 1,*.P<0.05;compared with group 2,#.P<0.05.

图2 枸杞多糖对小鼠红细胞NKEF-A、NKEF-B表达的影响Fig.2 Effect of Lycium Barbarum polysaccharides on NKEF-A，NKEF-B expression of erythrocytes in miceNote: 1.Normal control group;2.Model group;3.LBP 62.5 mg/kg group;4.LBP 125 mg/kg group;5.LBP 250 mg/kg group.Compared with group 1,*.P<0.05;compared with group 2,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.3对红细胞中NKEF-A、NKEF-B表达的影响 与正常组比较，模型组的红细胞NKEF-A、NKEF-B表达量均显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01，图2)。与模型组比较，枸杞多糖各剂量组NKEF-A、NKEF-B表达水平均有不同程度的恢复：枸杞多糖三个剂量均显著恢复小鼠红细胞NKEF-A表达(P<0.05或P<0.01)；枸杞多糖125、250 mg/kg两个剂量均能显著恢复小鼠红细胞NKEF-B表达水平(P<0.01)。

GroupsDose(mg/kg)nPI+H22(%)Normalcontrol-614 18±1 673)Model-612 15±0 631)LBP62 5613 82±0 902)250614 23±0 843)

Note：Compared with normal control group,1)P< 0.01;Compared with model group,2)P< 0.05,3)P< 0.01.

2.4对小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响 红细胞通过分泌NKEF可以增强NK细胞的杀伤活性，因此本研究同时也考察了枸杞多糖对化疗小鼠NK细胞杀伤活性的影响。结果如表2所示，模型组小鼠脾NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性较正常组明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。枸杞多糖处理的小鼠的NK细胞杀伤活性基本恢复正常，与模型组的比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；而与正常组的比较，差异无统计学意义。

3 讨论

本研究考察了枸杞多糖对小鼠红细胞免疫功能的影响，结果发现其对阿霉素化疗小鼠Band-3、NKEF-A和NKEF-B的表达及脾NK细胞杀伤功能均具有显著的恢复作用。事实上，枸杞多糖的免疫调节活性早已有文献报道，然而多数研究关注其对树突状细胞、淋巴细胞和巨噬细胞功能的影响，对红细胞免疫功能的影响尚缺乏系统性研究。现有研究已证实红细胞免疫系统作为机体免疫系统的组成部分，与肿瘤的发生和转归密切相关，因此如何维持其免疫功能正常意义重大。

红细胞免疫主要通过免疫调控和免疫黏附两种途径参与机体抗肿瘤免疫应答。红细胞对NK细胞、T细胞和巨噬细胞等免疫细胞功能均有调控作用[16]。NK细胞是固有免疫系统的重要成员，可以通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞而发挥抗肿瘤作用[17,18]；红细胞胞浆中存在一类能增强NK细胞功能的可溶性蛋白，即NKEF，在人体内该类因子包括NKEF-A和NKEF-B[7]。本研究结果显示枸杞多糖可以增强化疗小鼠NK细胞杀伤活性，结果与相关研究报道一致[19]。研究同时发现枸杞多糖可以提高化疗小鼠NKEF的表达水平，这提示枸杞多糖可能通过增强化疗小鼠红细胞NKEF的表达水平进而提高了NK杀伤活性。红细胞的免疫黏附作用主要由细胞膜表面的补体受体所介导，并且受一类调节蛋白调控，例如CD59分子。CD59分子通过与补体成分C7、C8和C9结合以抑制补体介导的免疫复合物的形成，其表达在红细胞膜上可以抑制红细胞免疫黏附作用[14]。本研究结果发现，小鼠化疗后红细胞CD59表达水平具有升高趋势，而枸杞多糖可以促进该分子表达水平恢复。事实上，文献报道枸杞多糖可以促进补体受体介导的红细胞免疫黏附作用[13]，在人红细胞上该黏附作用主要由补体受体1(Complement receptor 1,CR1)所介导[20]。由此可见枸杞多糖促进红细胞免疫黏附作用可能与其影响调节蛋白的表达水平有关。本研究还考察了枸杞多糖对Band-3蛋白表达的影响，结果显示小鼠化疗后红细胞膜Band-3蛋白表达下降，而枸杞多糖则可以恢复该蛋白的表达。由于Band-3蛋白是红细胞膜结构蛋白和功能蛋白，对维持正常的红细胞形态和功能至关重要[21]，因此推测枸杞多糖提高化疗小鼠红细胞免疫功能与恢复该蛋白表达水平有密切联系。

综上所述，枸杞多糖对阿霉素化疗小鼠红细胞免疫功能具有改善作用，相关作用机制仍需要进一步的研究。

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