过氧乙酸-乙醇联合辐照灭菌对脱钙骨基质成骨诱导活性的影响*

李雄涛余国荣*余黎张旗邓凯

同种异体脱钙骨基质（DemineralizedBoneMatrix,DBM）是一种良好的骨移植材料，具有诱导成骨、利于新骨形成及爬行替代等优点[1]。临床应用 DBM取材于异体骨，细菌、病毒等致病微生物的污染难避免，在消毒的同时，如何更好地保持DBM的成骨诱导活性，仍是尚待研究的问题，所以适当的消毒处理方式十分重要。钴-60照射对细菌、霉菌及病毒有较好的杀灭作用[2]，故本文选用20kGy钴-60射线对脱钙骨基质骨诱导活性的影响进行研究。PES（acid-ethanol sterilization）溶液为用含体积分数1%过氧乙酸与体积分数24%乙醇组成的过氧乙酸-乙醇消毒液，目前使用PES溶液灭活骨植入材料中的病毒有逐渐增多的趋势[3]，Pruss等[4]研究发现 PES溶液对脂膜病毒和非脂包膜病毒均有良好的灭活效果。目前，PES溶液灭活病毒后DBM成骨诱导活性是否有影响，尚没有相关报道，故本文就 PES联合辐照灭菌对DBM成骨诱导活性的影响进行相关研究。

1 材料与方法

1.1 DBM骨胶囊的制备及灭菌

选用200 g～300 g雌性SD大鼠50只（武汉大学动物实验中心提供），处死后取长管骨（肱骨、尺桡骨、股骨、胫腓骨）骨段压碎后用手工磨粉器将其制作成骨粉，用分析筛筛选125 m～800 m的骨粉备用。10℃～12℃条件下，用0.6mol/L的盐酸（pH值为2）对骨粉进行脱钙，磁力搅拌器持续搅拌24h，更换盐酸溶液后又脱钙24h。用纯化水反复冲洗骨粉1h。用乙醇复合溶剂进行脱脂，磁力搅拌24 h。取1/2的骨粉，用纯化水进行反复震荡冲洗40min，-40℃深低温冰柜贮存。另1/2的骨粉用配制的PES复合溶液进行搅拌4 h后用纯化水进行反复清洗震荡40 min，-40℃深低温冰柜贮存。将所有骨粉同时进行冷冻干燥材料24h。将经PES处理的骨粉30 mg装入1粒明胶胶囊中，共40粒。用20kGy的钴-60射线进行辐照灭菌；未用PES处理的冷冻干燥骨粉每粒胶囊装30 mg，共40粒，用20kGy钴-60射线辐照。

1.2 动物模型的制作与分组

选用雌性200 g～300 g SD大鼠40只（武汉大学动物实验中心提供），将80粒骨胶囊分为两组：A组为PES溶液+20kGy钴-60射线消毒组，设为实验组；B组为20kGy钴-60射线消毒组，设为对照组。大鼠以戊巴比妥钠（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，腰背部常规备皮、消毒、铺巾。取腰背部正中纵形切口，长约3 cm。切开皮肤后，找到腰椎两侧腰大肌，将腰大肌钝性分离，在两侧腰大肌内分别植入A组和B组的DBM骨胶囊，将腰大肌原位缝合，逐层缝合伤口。术后正常饮食进水，术后当天给每只SD大鼠肌注四环素 (Amersco公司 美国)，剂量为40 mg/kg；术后4周给每只SD大鼠（已经处死的不再注射）腹腔注射二甲苯酚橙（国药集团），剂量为30 mg/kg。

1.3 观察指标

1.3.1 植入后DBM骨粉大体形态及组织形态学观察

分别在术后2、4、6、8周处死6只 SD大鼠，将之前植入的DBM骨胶囊取出，进行大体形态观察。

1.3.2 植入后DBM中微血管密度测定

对骨胶囊进行固定，脱水，透明，透蜡和包埋，切片，常规行HE染色，用SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法免疫组化观察 CD31阳性新生血管内皮细胞。低倍镜（100×）下全面观察切片以确定切片血管密度最高处，高倍镜（200×）下以切片内任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管计数，记录5个视野内的微血管数（microvesselquantity MVQ）并取其均值。

1.3.3 新生骨生长速率测定

术后8周处死6只SD大鼠，将脱钙骨基质骨块完整取出（厚度约为1.5 cm），用70%乙醇溶液固定1～2天，用70%、85%、95%、100%的乙醇逐级梯度脱水，每个浓度时间为2～3天。间歇抽真空处理（-0.64大气压），15min/h。二甲苯中充分透明后，加入适量甲基丙烯酸甲酯（MMA）包埋，用蒸馏水冲洗干净样品表面，在SM2500硬组织切片机上进行切片，切片厚度约为15 m[5]。使用激光扫描共聚焦荧光显微镜（德国Leica公司型号：TCSSP2 AOBSMP），对四环素（黄色荧光）和二甲苯酚橙（红色荧光）在骨组织内的荧光进行观察，并通过图像分析系统对两条荧光带之间的距离进行测量，每张切片测量10个点之间的距离，取其平均值作为新骨的生长厚度，反映新生骨成骨速率的快慢。

1.3.4 钙、无机磷、碱性磷酸酶含量测定

术后8周将10只SD大鼠处死，将脱钙骨基质骨块完整取出，清除每组各十颗DBM骨块表面肌肉及软组织，分别用钙测定试剂盒（南京建成生物工程研究所C004）、无机磷测定试剂盒（南京建成生物工程研究所C006）、碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所A059-2），按试剂盒说明，对样本中的钙含量、无机磷含量、碱性磷酸酶含量进行检测。

1.4 统计学分析

结果以均数±标准差表示，采用 SPSS 17.0统计学软件处理数据。新生微血管数量比较采用析因设计方差分析，钙、磷、碱性磷酸酶含量比较采用 检验。

2 结果

2.1 植入后DBM骨粉大体形态及组织形态学观察

术后所有大鼠均存活正常，伤口均无感染。2、4、6、8周时将DBM骨块取出时，发现所有胶囊均已完全吸收，其中PES消毒液+20kGy的钴-60射线消毒组（实验组）所植入DBM骨粉为散在颗粒样，无固定形状（图1A），20kGy的钴-60射线消毒组（对照组）DBM 骨粉则呈卵圆形，质地较硬，颜色灰白的骨块（图1B）。

图1，DBM骨块8周时取出后的大体形态：A为实验组；B为对照组。

2.2 新生微血管定量分析

两组切片在第2周时均可见较多染成棕色的微血管侵入DBM形成的骨块中（见图2），4周以后侵入DBM骨块的微血管数（MVQ）下降，并保持在较为稳定的水平（见图3）。实验组各周的MVQ计数均少于对照组，差异有统计学意义（＜0.01）。

图2，2周时DBM骨块切片镜下观（200×）：A为实验组，MVQ值：（9.4±1.14）；B为对照组，白色箭头为DBM骨块中新生微血管，MVQ值：（11.2±1.92）（彩图见插页）。

图3，MVQ测定结果柱状图：横轴为时间，纵轴为MVQ计数。浅色柱为实验组、深色柱为对照组。实验组各周的MVQ计数均少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 新生骨生长速率定量分析

通过共聚焦荧光显微镜发现各组切片均有不同程度荧光染色。两组均经图像分析系统在两荧光标记间取10点测量距离，结果示：对照组（见图 4-B）平均距离为 88.95 m（见图4-B3），其生长速率为88.95/56d=1.59 m/d；实验组（见图4-A）仅有部分骨质有荧光染色，而且两种荧光重叠严重，无法进行宽度测量。

图4，激光共聚焦显微镜荧光扫描图像：（SD大鼠同种异体骨移植材料，15 m厚骨磨片，标尺150 m，黄色为四环素染色，红色为二甲苯酚橙染色）。A为实验组、B为对照组（A1、B1为黄色荧光通道，A2、B2为红色荧光通道，A3、B3共聚焦扫描复合图像，彩图见插页）。

2.4 钙、磷、碱性磷酸酶含量测定

钙、磷、碱性磷酸酶含量（见表1），钙含量的测定结果：实验组均值小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；无机磷含量测定结果：实验组均值小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；碱性磷酸酶含量测定结果：实验组均值小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1，Ca、P、ALP含量测定结果 （n=30，±s）

表1，Ca、P、ALP含量测定结果 （n=30，±s）

注：实验组为PES溶液+20kGy的钴-60射线消毒组、对照组为20kGy的钴-60射线消毒组；与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

Ca（nmol/gprot） P 含量（mmol/L） ALP 含量（U/gprot）实验组 0.73±0.16* 8.87±0.87** 0.098±0.016*对照组 1.07±0.45 9.17±0.14 0.121±0.019

3 讨论

脱钙骨基质（DBM）是指由同种异体骨或异种骨经过脱钙、脱脂、脱蛋白等处理，降低了免疫原性的骨移植材料，是理想的组织工程支架材料[6]。DBM诱导成骨的过程实质就是其中所含的骨形成蛋白（BMP）和其他生长因子协同作用的过程。因为存在于骨中的BMP被矿物成份包绕，未脱钙骨并没有诱导成骨能力，脱钙后则使BMP顺利释放，从而起诱导成骨的作用。间充质细胞是可以诱导的成骨祖细胞（IOPC），当其与DBM接触，使血管的间充质细胞被持续诱导，分化成软骨和骨，Reddi将这种由骨基质诱导成骨的过程描述为一种软骨内成骨过程[7]。本实验中采用的是同种异体DBM，通过不同的消毒灭菌的方法后，植于大鼠肌肉组织中，能够较好的模拟临床上植骨所处的骨性环境，可以有效地评价其成骨诱导能力所受的影响。

目前大多数组织库常使用辐照灭菌作为主要灭菌方法，钴-60射线辐照通过激发电子以及通过促进·H和·OH自由基生成，使微生物中的蛋白、核酸等灭活而起到灭菌作用。由于剂量过大时将降低骨的诱导能力，40kGy的钴-60射线辐照可以完全破坏骨移植物的骨诱导活性[8]，所以一直以来25kGy的钴-60射线辐照被认为是最佳剂量，因为它既可以有效的灭菌，又能保留部分骨诱导能力。但Nguyen H[9]认为0-25kGy钴-60射线辐照对诱导成骨能力的影响关系尚不明确，在少于25kGy钴-60射线也可达到了灭菌标准情况下，可以选择更小的剂量。而美国组织库协会认为辐照灭菌剂量不应该低于15kGy[2]，因为辐照灭菌剂量到达15kGy时才能保证灭菌水平达到安全水平。桑宏勋[8]认为钴-60射线辐照剂量在20kGy以上时对成骨诱导活性有较大影响。因此我们本次实验设计钴-60射线辐照灭菌剂量确定为20kGy，以此评价其对成骨诱导活性的影响。PES溶液为体积分数1%过氧乙酸与体积分数24%乙醇组成的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸有很强的杀灭病毒的作用，而乙醇可降低液体表面张力，有助于PES溶液完全渗透到DBM中[4]。因此 PES溶液对病毒有很好的灭活作用[10]，但是 PES溶液对细菌及真菌灭活效果不理想，特别是对黑曲霉的灭活效果差[5]。钟昱文[11]通过模拟现场消毒试验，结果表明，含量为1000 mg/L的过氧乙酸对30个染菌作用10 min后，平均仅杀灭3个以上对数值。而20kGy的钴-60射线灭菌效果确切，所以我们将DBM经PES溶液处理后再加用20kGy的钴-60射线消毒，以此来评价PES联合辐照灭菌对DBM成骨诱导活性的影响。

从DBM骨块取出后的大体情况看，20kGy的钴-60射线消毒（对照组）后骨块形态较为完整（见图1-B），而PES溶液+20kGy的钴-60射线消毒（实验组）后取出骨块形态不完整，大部分呈散在颗粒状（见图1-A）。钙、磷、碱性磷酸酶含量测定结果显示：实验组钙、磷、碱性磷酸酶含量均小于对照组，且差异有统计学意义。以上实验结果均说明PES联合辐照灭菌对DBM骨诱导活性有负面影响。

由于血管内皮生长因子（VEGF）一定程度可以启动并促进BMP的表达。术后7～28天为VEGF的表达高峰期，而VEGF和血管的重建密切相关[12]，所以在第2周时均可见较多微血管侵入 DBM 形成的骨块中，而4周以后侵入DBM骨块的微血管数反而下降。对照组切片的微血管计数（MVQ）均大于实验组，说明PES联合辐照灭菌对DBM骨诱导活性有负面影响。

通过共聚焦荧光显微镜发现各组切片均有不同程度荧光染色。我们在两组图像分析系统中任意取10点测量荧光带间的距离，而传统的距离测量法来测量新生骨生长速率是通过两荧光标记间最宽的的距离来计算的[13]，用传统方法测量B组两荧光标记间最宽的的距离为110.96 m，其速率为110.96

m/56 d=1.98 m/d，而A组荧光染色重叠严重，同样可以提示对照组的成骨诱导活性优于实验组。另外，从图4可以看到，有部分荧光染色部分重叠，这可能是由于四环素代谢需要一定时间[14]，所以对新骨部位经过共聚焦显微镜荧光扫描后发现两次荧光标记带有部分重叠，随着四环素的代谢和新骨生长，新生骨染色应以二甲苯酚橙染成红色为主 (见图4-B3)，说明对照组新生骨生长较为正常。如果两种不同荧光标记颜色无法分开(见图4-A3)，则提示新生骨生长较为缓慢。说明PES联合辐照灭菌对DBM成骨诱导活性有负面影响。

综上所述，上述实验结果均说明PES溶液消毒对脱钙骨基质骨诱导活性的影响较辐照灭菌大。其作用机理可能如下：过氧乙酸可能会直接攻击骨形成蛋白，影响它的活性；过氧乙酸可能会破坏骨胶原和骨基质空间网络结构，骨形成蛋白在发挥作用时需要支架，而骨胶原是骨形成蛋白的最好支架[15]，缺少了支架骨形成蛋白的作用的发挥就受到限制。

因此，我们认为PES联合辐照灭菌灭活病毒后，对DBM的成骨诱导能力有一定的负面影响。但是临床上我们通常是在骨缺损的情况下进行植骨，所以在骨性环境下PES联合辐照灭菌对DBM成骨诱导能力的影响有多大，还有待进一步研究。

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