桑葚酵素生物活性的检测与研究

王瑾，刘新利

(齐鲁工业大学 生物工程学院，济南 250353)

桑葚(Mulberry)，又作桑椹，为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥果穗。桑葚为聚花果，颜色主要有黄棕色、棕红色至暗紫色，还有的成熟后呈乳白色。我国有15个桑种和3个变种，是世界上桑树品种最多的国家之一。桑葚酸甜可口，味道鲜美，是人们经常食用的水果之一。传统中医认为桑葚既能入食，也能入药，味甘酸，性微寒。除作为滋补品外，桑葚还具有调节人体免疫力、降低人体内血糖和血脂、抗氧化、抗衰老、保护肝脏、促进造血细胞生长等作用。主治阴血不足而致的头晕目眩、耳鸣心悸、烦躁失眠、须发早白等症[1]。常食桑葚能够补益肝肾，滋阴养血，清肝明目，提高人体免疫力，延缓衰老。

酵素是以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品[2]。在之前的文献报道中可以看到，很多人把酵素误以为是“酶”。然而经现代研究发现，酵素不等于我们传统意义上所

说的 “酶”。酵素的营养主要来自于三个方面：首先，酵素中含有黄酮类物质、植物色素和各种酶类等活性成分，可消除不利于健康的活性氧，帮助人体抗氧化、防衰老。其次，酵素属于发酵产品，其含有的活性益生菌进入肠道后，可以迅速进行生长繁殖，起到预防感染、维持肠道内菌群平衡的作用。第三，酵素原料来源丰富，原料中含有的氨基酸、维生素、矿物质等各种营养成分也有益于人体的健康[3]。因此，酵素是一种营养丰富的发酵产品，其内部含有的营养物质以及抗氧化成分均对人体有益，多饮酵素能够改善人体肠道环境，延缓衰老，提高人体免疫机能。

目前，酵素研发已经成为一股新的“市场热”，各种酵素产品相应上市，国家也正在出台一系列相应的标准以确保酵素市场的安全与稳定。关于桑葚酵素，目前研究较多的就是关于桑葚酵素的研制工艺，如何改善其口感，而关于其生物活性方面的研究鲜有报道。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

桑葚酵素：市场上某公司购买的桑葚酵素。

1.1.2 试剂

没食子酸标准品、福林酚试剂、碳酸钠、原花青素标准品、硫酸铁铵、甲醇、异丙醇、甲酸、正丁醇、浓盐酸、过硫酸钾、无水乙醇等，分析纯；DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)，Sigma公司；ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))，阿拉丁公司。

1.1.3 仪器

紫外可见分光光度计(UV 6100型)；高效液相色谱仪(岛津LC-20AT型)。

1.2 桑葚酵素的制备

选取新鲜桑葚→打浆→添加C、N源→灭菌→接入酵母菌、乳酸菌等益生菌→发酵→检测pH值→过滤→后熟→成分检测→加糖调节口感。

1.3 酵素中抗氧化物质的检测

1.3.1 多酚含量的测定

本研究采用Folin-Ciocalteau法测定酵素中的总酚含量，配制1000 μg/mL的没食子酸标准储备液，再稀释成浓度分别为10，20，30，40，50 μg/mL的没食子酸工作液。量取没食子酸工作液和蒸馏水各1 mL于试管中，再分别加入5.0 mL的10%福林酚试剂，摇匀，反应3～8 min内，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，摇匀，室温下放置60 min，用10 mm比色皿在765 nm波长下测吸光值[4]。根据结果绘制标准曲线。再将酵素溶液进行一定倍数的稀释，量取1 mL进行测定。样品重复测定3次。

1.3.2 原花青素含量的测定

参照GB/T 22244-2008，采用高效液相色谱法测定酵素中原花青素的含量，检测原理是样品中原花青素单体或聚合物在加热的酸性条件和铁盐催化作用下，C-C键断裂，然后生成深红色的花青素离子即氰定[5]，再使用高效液相色谱进行分析，从而确定试样中原花青素含量。

称取原花青素标准品0.5 g溶于10 mL甲醇中，吸取该溶液0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 mL置于10 mL棕色容量瓶中(最终浓度分别为0.5，1.25，2.5，5，7.5 mg/mL)，加甲醇至刻度，摇匀。各取2 mL测定。把正丁醇和浓盐酸按照95∶5的体积比进行混合，量取15 mL置于具塞锥形瓶中，再加入0.5 mL硫酸铁铵溶液(2%)和2 mL试样溶液，混合均匀，将锥形瓶放置于沸水浴中精确加热40 min，再立即放入冰水中进行冷却，经0.45 μm滤膜过滤，待进行高效液相色谱分析。取2 mL样品进行测定。高效液相色谱条件见表1。

表1 高效液相色谱条件

1.4 酵素抗氧化实验

1.4.1 对DPPH·自由基清除作用的测定

DPPH·自由基清除能力的测定根据Wang X Z等描述的方法，先用蒸馏水将酵素样品稀释成不同浓度的测试液，然后配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH·溶液，即准确称取10 mg DPPH·用无水乙醇溶解到250 mL容量瓶中。取2 mL DPPH·溶液与1 mL待测液混合均匀，室温下放置30 min，在517 nm波长下测定其吸光度，用95%的乙醇溶液做空白对照[6]。

抑制率(%)=(1—AS/A0)×100。

式中：AS为2 mL DPPH·溶液与1 mL样品的吸光度；A0为2 mL DPPH·溶液与1 mL 95%乙醇的吸光度。

1.4.2 对ABTS·自由基清除作用的测定

准确称取ABTS·3 mg，加蒸馏水0.735 mL，配制成7.4 mmol/L的ABTS·储备液；再准确称取K2S2O81 mg，加蒸馏水1.43 mL，配制成2.6 mmol/L K2S2O8储备液。分别量取0.5 mL的ABTS·储备液和K2S2O8储备液，混合均匀，黑暗条件下室温放置12 h。然后用95%乙醇进行稀释，稀释到A734 nm=0.7±0.02。取2 mL的稀释液与0.5 mL不同浓度梯度的酵素溶液混合，室温下放置6 min后，在734 nm下测吸光值。用95%的乙醇溶液作为空白对照[7]。抑制率的计算公式如下：

抑制率(%)=(1-AS/A0)×100。

式中：AS为2 mL ABTS·溶液与0.5 mL酵素稀释液的吸光度；A0为2 mL ABTS·溶液与0.5 mL 95%乙醇的吸光度。

1.4.3 桑葚酵素中SOD活性测定

采用邻苯三酚自氧化法测定桑葚酵素中SOD的活性[8]，按照表2，在对照管与样品管中加入相应体积的缓冲液和双蒸水，放置到25 ℃恒温水浴锅中保温20 min后，再加入预热过的25 ℃邻苯三酚(对照管中用10 mmol/L盐酸溶液进行代替)，迅速摇匀后立即倒入10 mm比色皿中，在波长325 nm处每隔30 s测定1次吸光值A0。测定样品中SOD活性时，在样品管中加入0.5 mL稀释后的样品溶液和3.7 mL双蒸水，其他步骤一致，得到ASOD。

表2 邻苯三酚自氧化速率测定加样表

抑制率(%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100%，酶活力(U/mL)=(抑制率/50%)×(V1/V2)×n。

式中：V1为反应液的总体积，mL；V2为测定样品的体积，mL；△A0为邻苯三酚自氧化速率；△ASOD为样品光密度值变化速率；n为酵素稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 桑葚酵素抗氧化物质含量检测结果

2.1.1 多酚含量测定结果

多酚类化合物，具有抗氧化、延缓衰老、降血压、防龋齿、防辐射、抗过敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性[9]，是一种优良的天然抗氧化物质，在医药和食品业具有广泛的应用。多酚的标准曲线见图1，线性回归方程为：y=86.987x-1.3674(R2=0.9995)。

式中：y为没食子酸标准品浓度(mg/L)，x为吸光度。标准曲线表明没食子酸在浓度为10～50 mg/L区间有良好的线性关系。桑葚酵素稀释50倍后吸光值为0.387，代入标准曲线公式得到其多酚含量为32.30 mg/L，则酵素中多酚物质含量为1.615×103mg/L。

图1 没食子酸标准曲线

2.1.2 原花青素含量测定结果

原花青素，简称OPC，一种在多种植物中都有存在的多酚类化合物，名称来源是其在加热的状态下能产生红色的花青素，它在医药、化妆品及食品行业中有广泛的应用。实验研究表明：原花青素的抗自由基氧化能力是维生素C的20倍、维生素E的50倍，并且能够被人体迅速吸收，口服20 min即可达到最高血液浓度，代谢半衰期长达7 h[10]，是一种优良的天然抗氧化物质。

原花青素标准品检测见表3，标准曲线见图2，线性回归方程为：y=3×10-6x-0.3728(R2=0.9992)。

式中：y为原花青素浓度(g/L)，x为吸光度。标准曲线表明原花青素在浓度为0.5～7.5 mg/mL区间有良好的线性关系。

表3 原花青素标样峰面积和浓度对比

图2 原花青素标准曲线

桑葚酵素液相的峰面积为1905871，代入标准曲线得原花青素浓度为5.344 mg/mL。

2.2 桑葚酵素抗氧化实验结果

2.2.1 桑葚酵素对DPPH·自由基的清除作用

DPPH·是一种很稳定的自由基，其中心物质是氮，若某物质能够将其清除，则表明该物质具有降低羟自由基、烷自由基或氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH·溶于乙醇溶液后呈现深紫色，它有一个孤电子，在517 nm处有强吸收峰。当有自由基清除剂时，会与之反应变成无色或浅黄色，在517 nm处吸光值也随之降低[11]，可以用此来计算清除率，实验结果见图3。

图3 桑葚酵素清除DPPH·自由基能力

由曲线可知，桑葚酵素具有较高的DPPH·自由基清除能力，用SPSS求得IC50值为稀释18.796倍，即浓度为0.0532，远高于其他水果酵素。这可能是由于桑葚中含有抗氧化能力较高的原花青素以及多酚物质，具有良好的DPPH·自由基清除能力。

2.2.2 桑葚酵素对ABTS·自由基的清除作用

ABTS·在氧化剂作用下能够氧化成绿色的ABTS·，当有抗氧化物存在时，ABTS·的产生会得到抑制，在734 nm处有最大吸收波长，测定该波长下ABTS·相应的吸光度即可计算出样品的总抗氧化能力[12]，实验结果见图4。

图4 桑葚酵素清除ABTS·自由基能力

由图4可知，桑葚酵素具有较高的ABTS·自由基清除能力，用SPSS求得IC50值为稀释7.456倍，即浓度为0.134。

2.2.3 桑葚酵素内SOD测定结果

将桑葚酵素稀释10倍后进行SOD活性检测，经计算，当桑葚酵素浓度为10%时，抑制率达76.23%，再根据稀释倍数算出桑葚酵素的SOD活力为240 U/mL。这表明桑葚酵素具有较强的自由基清除能力，具有抗衰老、免疫调节、调节血脂、抗辐射和美容的功能。

3 结论

本文从桑葚酵素的抗氧化成分以及对不同自由基的清除能力方面对其进行了初步研究。研究结果表明：桑葚酵素中的多酚物质和原花青素含量较高，对DPPH·自由基有较强的清除作用，对ABTS·自由基也有一定的清除作用，这与它较高的多酚浓度和原花青素浓度有一定的关系。这表明桑葚酵素能够清除人体内的自由基，减少自由基对人体造成的伤害，具有增强人体免疫力、抗氧化和抗衰老的功能。此外，桑葚酵素中也具有较高的SOD酶活性，具有很好的美容养颜的功效，是一种营养丰富的优良保健饮品。

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