microRNA对体细胞重编程为神经细胞的研究进展

许婷婷 ，王跃嗣

（1.潍坊护理职业学院，山东 青州 262500；2.滨州医学院医药研究中心，山东 烟台 264003）

随着社会老龄化进程的加剧，各种神经退行性疾病的发病人数也逐年增加。神经退行性疾病和神经系统损伤（如脑缺血、脑中风、脊髓损伤等）严重威胁着人类的身体健康。帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风等均是由于分化成熟的神经细胞受到损伤不能分裂增殖以弥补损伤或死亡细胞所造成的，因此寻找新的神经元细胞对治疗神经退行性疾病具有重要意义。虽然胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ESC）、诱导多能性干细胞（induced Pluripotent Stem Ccell，iPSC）能够在体外分化形成神经细胞，但其应用于临床前受到分化效率低、易形成肿瘤危害等限制。自2006年Takahashi等[1]发现细胞重编程技术以来，细胞重编程技术越来越受到国内外学者的青睐。将体细胞作为靶细胞，重编程形成神经细胞，使治疗神经系统疾病成为可能。

1 细胞重编程

把体细胞重编程为iPSC是一项具有革命性的技术[2]。2006年 Takahashi和 Yamanaka[1]第一次把 Oct4、Sox2、Klf和 c-Myc 4个转录因子通过逆转录病毒转染方式在小鼠成纤维细胞上过表达形成iPSC，这些细胞与小鼠ESC具有相似的生长特性和形态。因为c-Myc是原癌基因，形成的iPSC具有癌变可能，自从iPSC产生以来就存在癌变的潜在危险，如果无法解决癌变可能，iPSC就无法在临床上应用。因此，研究人员开展了多种替代研究，企图实现同时具有iPSC功能，又不具有癌变潜能的新的重编程分子。后来研究人员又整合了包括Nanog、Esrrb、Nr5a2等多种不同基因重编程为成纤维细胞和其他不同类型的体细胞，但是Oct4却不能被其他因子所替代，这表明在细胞重编程中它起到特定的作用。

2 miRNA参与细胞重编程

为提高细胞重编程的效率，研究人员试用了各种不同的小分子和特定的miRNA。在细胞重编程转染Oct4、Klf4和Sox2（OKS）的同时，想用miRNA替代c-Myc，结果发现[3]，瞬时转染miR-291-3p、miR-294或miR-295可以形成iPSC，且能增加iPSC形成数目。跟c-Myc不同，在去分化的早期阶段，miR-294不会诱导小鼠成纤维细胞增殖，与外源性的c-Myc相比，miR-294能产生同源的iPSC克隆。

目前已有研究表明[4-5]，只用miRNA就可以诱导细胞发挥多能性。在没有转录因子的情况下，只用逆转录病毒过表达miR-302/367能诱导小鼠和人的成纤维细胞形成iPSCs[4]，这些细胞注入囊胚后可形成畸胎瘤，并且过度表达miR-302/367能加速细胞重编程，提高编程效率，但在不表达miR-367的条件下，培养3周后仍然没有获得iPSCs的克隆，这就暗示miR-302/367介导的重编程中需要有miR-367的表达。实验发现[5]，瞬时转染miR-200c、miR-302和miR-367这一组合可以重编程小鼠和人的体细胞。尽管到目前为止，miRNA介导的重编程还没被广泛用于实验，但是研究人员已经开始重视miRNA的作用。用经典的四因子重编程小鼠成纤维细胞时，加入miR-302家族和miR-290家族能轻微提高细胞重编程效率，但在没有其他转录因子的情况下，这两个家族的miRNA不能完成诱导。

另一研究[6]表明了miRNA在细胞重编程中的重要作用，成纤维细胞在缺失所有成熟miRNA的情况下不能形成iPSCs。因此，miRNA不仅在多能细胞的分化中是必须的，还在纤维细胞的去分化过程中起着重要作用。

在细胞重编程的最初阶段，许多miRNA家族被认定为上皮-间充质之间转化（MET）的介质，而MET存在于体细胞重编程的起始阶段。其中，研究较详细的是miR-205和miR-200家族，它们都是由BMP诱导而成，并且参与维持细胞的多能性。miR-200家族可以通过抑制E-cadherin的抑制因子Zeb1和Zeb2，还有Snail和Slug来促进MET[7]。除了miR-200家族，还有许多其他的miRNA家族能够提高细胞重编程效率。表达分析在mESCs重编程起始阶段中高表达的miRNA家族，显示在重编程的前 4 天，miR-17/92、miR-106b/25、miR-106a/363 和miR-302b/367会有表达[8]。通过促进MET，miR-106b/25家族能增强iPSC的诱导。转染miR-93和miR-106b可以增加iPSCs克隆的数目，而抑制这两种miRNA可以减少克隆的数目。在人成纤维细胞重编程过程中，转染OSKC的第二天和第七天转染miR-302b和miR-372可以增加克隆的数目[9]。miR-302b、miR-372和miR-294具有相同的种子序列，能够阻止在人类永生化表皮细胞中TGF-β诱导上皮-间充质之间的转化（ETM）。并且，经过改良的具有突变种子序列的miR-294不能抑制TGF-β诱导ETM，这就表明了种子序列在这些miRNAs中的重要性。

miR-21和miR-29a可以干扰iPSC的形成[10]，这两种miRNA都在小鼠成纤维细胞中大量表达，缺失这两种miRNA可以通过调节p53和ERK1/2通路来提高重编程效率。所有的研究都表明，miRNA不仅在维持未分化细胞的状态中起作用，也能影响已分化细胞的命运。

3 miRNA对神经系统的作用和重编程诱导作用

3.1 miRNA在神经系统中的表达

miRNA在神经发育过程中的神经元、神经祖细胞及神经胶质细胞中有特定表达。近年来，miRNA在干细胞及其分化中的作用开始受到关注。研究发现，某些miRNA，如miR-29和miR-126主要在星形胶质细胞中表达；而miR-138、miR-124主要在中枢神经系统中表达。在中枢神经系统中，部分miRNA的表达具有短暂性和区域性[11]。部分miRNA的表达模式与其发育阶段存在一定关联。miR-126可以负调控神经管发育中血管内皮生长因子A的表达，从而对神经系统血管网络的形成起间接的调控作用[12]，也有协同调节神经管发育过程中类胰岛素生长因子、Shh通路和神经营养蛋白通路的作用[13]。

在脑组织中表达最丰富的一类miRNA—miR-124，主要在已分化成熟的神经元中表达。若将miR-124转染到多种细胞中，可以抑制一系列非神经元转录物的表达，并且诱导这些细胞基因组向神经方向转化[14]。研究发现[15]，成纤维细胞可以在miR-124的参与下重编程，诱导分化为神经细胞。在功能上，miRNA可以通过引发靶mRNA的降解和翻译抑制来介导转录后基因的沉默，参与蛋白质表达的调节，在神经系统分化、发育及神经系统疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用[16]。有研究显示[17]，miR-124-9-9*不仅能够使成纤维细胞重编程为神经细胞，而且还可以提高米勒神经胶质细胞编程为视网膜神经元的概率。在已知的miRNA中，大约70%在哺乳动物大脑中有表达。很多miRNA参与了神经系统不同信号转导通路的基因表达调控且有不同的生理过程，比如神经系统发生和发育、神经干细胞的分化、树突棘形成、神经保护等[16]。有一些miRNA可以参与调节神经干细胞的分化和命运[18]。miRNA参与了很多神经系统疾病的病理生理过程，如帕金森病、脑肿瘤、精神分裂症等引起的神经系统损伤[19-20]。

3.2 miRNA参与细胞重编程为神经细胞

3.2.1 miRNA参与重编程为神经前体细胞及神经干细胞2011年3月，Janghwan Kim等[21]把小鼠成纤维细胞重编程为神经前体细胞，他们以病毒为载体将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子转入成纤维细胞中，将这些细胞诱导分化为Pax+、Sox1+、Sox17+、T+的神经前体细胞（Neural stem/Progenitor Cells，NPCs）。2011年12月，Ernesto Lujan等[22]将小鼠成纤维细胞诱导分化为NPCs，基因嵌入Sox2-IRES-EGFP的小鼠中原代培养获得MEF，再将11种转录因子转染成纤维细胞，培养24天后，检测诱导形成的细胞为NPCs。 2012年2月，Dong Wook Han等[23]通过指定的转录因子将成纤维细胞重编程为神经干细胞，实验中，他们将相结合的转录因子诱导小鼠成纤维细胞而获得iNSCs，此类细胞表现出的细胞形态、基因表达的表观遗传特征、分化电位和自我更新能力与野生型的神经干细胞相似。2012年3月，Marc Their等[24]将成纤维细胞诱导分化稳定增殖的神经干细胞，通过组成性诱导Sox2、Klf4、c-Myc，同时在重编程的初始阶段严格限制Oct4的活性，分化形成了可以传代＞50代的神经干细胞iNSCs，iNSCs有巢蛋白、Pax6、Olig2的表达，此外，还可以分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。又有研究者用单个转录因子Oct4重编程人的血细胞诱导分化为神经祖细胞。在细胞重编程形成神经细胞的过程中，体细胞往往先形成多潜能干细胞再分化为神经细胞，但这一重编程效率很低，并且多数不能传代生长，还由于缺少再活化的重编程因子，多潜能干细胞往往可能会形成畸胎瘤，用于临床治疗，我们必须考虑形成肿瘤的风险和细胞在体外可自我再生。miRNA在iNSC重编程中的作用可以借鉴对iPSC的研究，有实验显示，小鼠和人的iPSC可以通过miRNA的组合和转录因子的重编程形成。组合的miRNA和转录因子可以使人成纤维细胞完成神经细胞的转化，并且可以往特定神经细胞类型分化。过表达miR-146可以促进神经干细胞增殖，促进胶质细胞分化。小鼠ESC 特异的 miRNA、miR-291-3p、miR-294、miR-295可以提高Klf4、Oct4、Sox2的诱导多能性，因此，可以筛选和研究NSC特异的miRNA来推动iNSC的形成。

3.2.2 miRNA参与重编程为神经元 2011年 5月，Ulrich Pfisterer等[25]将人成纤维细胞重编程成多巴胺神经元，通过过表达转录因子Ascl1、Brn2、Myt1Ⅰ，人成纤维细胞可以高效转化为功能型神经元。2011年7月，《Cell》上刊登了Esther YSon等[26]的实验，他们将小鼠和人的成纤维细胞重编程为功能性的运动神经元；同时，也报道了Rajesh Ambasudhan等[27]在一定的条件下，把人成纤维细胞重编程为功能型神经元，miR-124和两个转录因子（MYT1L、BRN2）的组合可以把中胚层人成纤维细胞重编程为外胚层功能型神经元。研究报道[28]，在人成纤维细胞中过表达miR-302/367家族和两种神经元特异性的miRNA（miR-9/9*、miR-124），可将其重编程为神经元，并且这些细胞可以在裸鼠脑中被观测到，这推进了细胞重编程的研究，并对神经系统疾病的治疗提供了理论支持。

3.2.3 miRNA参与重编程为神经胶质细胞 神经胶质细胞的再生过程中，许多miRNA也参与其中。miR-125b可以调节少突胶质细胞的增殖和星形胶质细胞的再生。星形胶质细胞在生理和病理的中枢神经系统中起重要作用，它可以参与突触形成、影响神经递质吸收等。在大脑发育过程中，星形胶质细胞中miR-29的表达比在神经元中的表达强烈，并且实验表明[29]，在细胞培养过程中，miR-29a在星形胶质细胞中表达非常强烈。有研究表明[30]，可以用miR-302/367再加VPA（组蛋白去乙酰基酶抑制剂）重编程人和鼠的星形胶质细胞诱导为神经细胞来治疗神经疾病。

4 展望

近年来，细胞替代治疗和基因治疗为人类征服多种疾病提供了希望。miRNA作为新的研究热点，在细胞重编程中越来越受到人们的重视。目前已有不少研究证实miRNA在体细胞重编程中起着重要作用，对于miRNA把体细胞重编程为神经细胞的研究也取得了一些进展，但在神经细胞重编程中，miRNA的作用机制仍然需要继续深入研究。这些研究必将加速促进体细胞重编程为神经细胞在生物医学领域的应用。iNSC细胞的重编程给细胞命运、药物发现和细胞移植研究提供了新的方法。随着研究的深入，iNSC的重编程可以进一步推动重编程的研究及探索。

[1]Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast culture by defined factors[J].Cell，2006（4）：663-676.

[2]Woltjen K，Kim SI，Nagy A.The piggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse[J].Methods Mol Biol，2016（1357）：1-22.

[3]RLJudson，JEBabiarz，M Venere，et al.Embryonic stem cell specific micro-RNAs promote induced pluripotency[J].NatBiotechnol，2009（27）：59-61.

[4]FAnokye Danso，CMTrivedi，DJuhr，et al.Highly efficient miRNAmediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency[J].Cell Stem Cell，2011（8）：376-388.

[5]NMiyoshi，H Ishii，H Nagano，et al.Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs[J].Cell Stem Cell，2011（8）：633-638.

[6]BMKim，MCThier，SOh，et al.MicroRNA are indispensable for reprogramming mouse embryonic fibroblasts into induced stem celllike cells[J].PLOS One，2012（7）：39239.

[7]Korpal M，Lee ES，Hu GH，et al.The miR-200 family inhibits epithelial mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of Ecadherin transcripfional repressors ZEB1 and ZEB2[J].J Biol Chem，2008，283（22）：14910-14914.

[8]ZLi，CSYang，KNakashima，et al.Small RNA-mediated regulation of iPS cell generation[J].EMBO J，2011（30）：823-834.

[9]D Subramanyam，S Lamouille，R LJudson，et al.Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J].NatBiotechnol，2011（29）：443-448.

[10]CSYang，ZLi，TMRana.MicroRNA modulate iPS cell generation[J].RNA，2011（17）：1451-1460.

[11]Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J].Cell，2007（7）：1401-1414.

[12]James J M，Gewolb C，Bautch VL.Neurovasular development uses VEGF-A signaling to regulate blood vessel ingression into neural tube[J].Develpoment，2009，136（5）：833-841.

[13]Shen W F，Hu Y L，Uttarwar L，et al.MicroRNA-126 regulates HOXA9 by binding to the homeobox[J].Mol Cell Biol，2008，28 （14）：4609-4619.

[14]Cheng L C，Pastrana E，Tavazoie M，et al.miR-124 regulates adult neurogenesis in the subventricular zone stem cell niche[J].Nat Neurosci，2009，12（4）：399-408.

[15]Yoo AS，Sun AX，Li L，et al.MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons[J].Nature，2011，476（7359）：228-231.

[16]Filipowicz W，Bhattacharyya SN，Sonenberg N.Mechanisms of posttranscriptional regulation by microRNAs：are the answers in sight[J].Nat Rev Genet，2008，9（2）：102-114.

[17]Wohl SG，Reh TA.miR-124-9-9*potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia[J].Glia，2016，64（5）：743-762.

[18]Stevavato L，Hicks C，Sinden JD.Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures，Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes[J].Journal of visualized experiments，2015（98）：112-114.

[19]Gao FB.Posttranscriptional control of neuronal development by miceoRNA networks[J].Trends Neurosci，2008，31（1）：20-26.

[20]Jeyaseelan K，Lim KY，Armugam A.MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion[J].Stroke，2008，39（3）：959-966.

[21]Janghwan Kim，Jem AEfe，Saiyong Zhu，et al.Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors[J].2011，108（19）：7838-7843.

[22]Ernesto Lujan，Soham Chanda，Henrik Ahlenius，et al.Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing，tripotent neural precursor cells[J].PNAS，2011，109（7）：2527-2532.

[23]Dong Wook Han，Natalia Tapia，Andreas Hermann，et al.Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors[J].Cell，2012（10）：1-8.

[24]Marc Their，Yenal BLakes，Raphaela，et al.Direct Conversion of Fibro blasts into Stably Expandable Neural Stem Cells[J].Cell，2012（10）：473-479.

[25]Ulrich Pfisterer，Agnete Kirkeby，Olof Torper，et al.Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons[J].PNAS，2011，108（25）：10343-10348.

[26]Esther YSon，Justin KIchida，Brian JWainger，et al.Conversion of Mouse and Human Fibroblasts into Functional Spinal Motor Neurons[J].Cell，2011（9）：205-218.

[27]Rajesh Ambasudhan，Maria Talantova，Ronald Coleman，et al.Direct Reprogramming of Adult Human Fibroblasts to Functional Neurons under Defined Conditions[J].Cell，2011（9）：113-118.

[28]Zhou C，Gu H，Fan R，et al.MicroRNA 302/367 Cluster Effectively Facilitates Direct Reprogramming from Human Fibroblasts into Functional Neurons[J].Stem Cells Dev，2015，24（23）：2746-2755.

[29]Ouyang YB，Xu L，Yue S，et al.Neuroprotection by astrocytes in brain ischemia；importance of microRNAs[J].Neuroscience letters，2014（565）：53-58.

[30]Ghasemi-Kasman M，Hajikaram M，Baharvand H，et al.MiroRNA-Mediated In Vitro and In Vivo Direct Conversion of Astrocytes to Astrocytes to Neuroblasts[J].Plos one，2015，10（6）：127.