奶牛隐性乳房炎大肠杆菌16S rRNA序列分析

谢 昆，蒋成砚，刘 杰，李桥善，周文树，唐秀华，汪 镜

(1.红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661199；2.云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室，云南蒙自 661199)

奶牛乳房炎是奶牛高发病之一，极大地影响了奶牛业发展[1]，根据临床表现可分为临床型、非临床型2种。其中，非临床乳房炎即隐性乳房炎，最主要是奶牛隐性乳房炎[2]，导致奶牛隐性乳房炎的病原菌主要有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌等，其中大肠杆菌较为重要[3]。目前，奶牛乳房炎的治疗主要靠抗生素，但是经过时间积累，大量使用或者滥用抗生素现象较为突出，导致抗生素大量残留在奶牛体内，最终导致其产生耐药菌株[4]。因此，尽早诊断出导致奶牛隐性乳房炎的病原菌，对人类健康和经济发展至关重要[5]。奶牛隐性乳房炎不仅给奶牛养殖业带来了巨大经济损失，而且牛奶也因为奶牛患病而使其营养价值下降，甚至当人类食用带有病原菌的牛奶后会给人类健康带来巨大威胁[6-7]。本研究在生理生化初步鉴定的基础上，提取病原菌DNA，设计特异性引物，通过分子生物学方法检测奶样中大肠杆菌16S rRNA，并与GenBank中发表的16S rRNA序列进行比较，以便建立一种检测奶样中大肠杆菌的分子生物学方法。

1 材料与方法

1.1 材料

经过生理生化鉴定的大肠杆菌为笔者所在实验室从奶样中分离保存。

1.2 细菌培养

在超净工作台中，将经过生化鉴定并进行纯化培养后初步确定的大肠杆菌接种到LB培养液中，再将培养液放置在37 ℃、150 r/min的摇床中培养24 h后提取细菌DNA。

1.3 细菌DNA提取

应用CTAB结合SDS法提取大肠杆菌DNA，取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量。

1.4 大肠杆菌16S rRNA的PCR扩增

根据GenBank上发表的大肠杆菌16S rRNA序列(NC002695)，应用Primier premier 5 引物设计软件设计1对特异性引物，引物序列如下：P1，5′-GAATCACAAAGT GGTAAGCGC-3′；P2，5′-TCGAACAATAACAGGAAACAGC-3′，以提取的细菌DNA为模板进行PCR扩增，反应条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，49.7 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，28个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取5 μL样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR产物的测序和分析

将PCR扩增产物送到深圳华大基因科技服务有限公司，完成正反测序，序列结果运用DNAStar软件进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 细菌DNA的提取

细菌DNA经CTAB结合SDS法提取后于1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，细菌DNA约为21 000 bp(图1)。

2.2 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

PCR产物经1%琼脂糖电泳检测，结果见图2，从图2可以看出，PCR产物约为1 400 bp，与预测结果一致。

2.3 序列同源性对比

PCR产物经测序后，将测序结果与GenBank中大肠杆菌16S rRNA基因序列(NC002695)进行同源性对比分析，发现二者序列相似性为96%，同源性对比结果见图3。

3 讨论与结论

细菌基因组DNA提取方法较多，有SDS法、CTAB法[8]、传统DNA抽提法、加热煮沸发、试剂盒抽提法、chelex 100法。 本研究利用SDS、CTAB混合法提取细菌基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测可看到细菌DNA提取过程中无污染，琼脂糖凝胶条带中无拖尾现象，说明细菌提取的基因组DNA较为完整。

16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，具有较高的保守性，由于16S rRNA基因核苷酸序列总长度适宜，结构完整，更便于对细菌进行各种研究。因此设计一对引物，以 16S rRNA 为靶分子在适当条件下进行PCR扩增，便得到扩增后的16S rRNA片段，将扩增后的16S rRNA基因序列与基因库中的片段比对，便可以知道未知菌与其他菌的同源性，从而完成对菌的鉴定。

[1]李永安.奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及防制研究[D].武汉：华中农业大学，2005.

[2]程振涛.奶牛隐性乳房炎的诊断方法与细菌学研究[D].贵阳：贵州大学，2006.

[3]苏俊强，王建亮，梁海锋，等.奶牛隐性乳房炎发生规律探讨[J].湛江海洋大学学报，2002，22(6)：65-68.

[4]闫常平.奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[D].哈尔滨：东北农业大学，2003.

[5]高会玲.双抗体夹心ELISA检测奶牛隐性乳房炎的研究[D].长春：吉林农业大学，2007.

[6]尹柏双，王秋竹，付连军，等.隐性乳房炎奶牛乳清中部分酶活性变化[J].江苏农业科学，2016，44(7)：276-277.

[7]罗志尧，陈天来.奶牛隐性乳房炎大肠杆菌的鉴定与药敏试验[J].江西畜牧兽医杂志，2013(4)：11-14.

[8]周 彪，郭政宏，严亨秀.藏猪粪便芽孢杆菌基因组DNA的提取方法[J].江苏农业科学，2016，44(4)：93-95.