丹曲胶囊抗心肌缺血再灌注损伤的线粒体保护机制

田心 徐攀 刘超峰

[摘要] 目的 探讨丹曲胶囊对心肌缺血再灌注损伤的线粒体保护机制。 方法 将健康雄性SD大鼠30只按随机数字表法分为五组，每组6只，分别为假手术组、模型组、丹曲胶囊300 mg/kg组、丹曲胶囊600 mg/kg组、单硝酸异山梨酯组（10 mg/kg）。采用左冠状动脉前降支结扎的方法造模，分别记录缺血/再灌注不同时间点ST段变化，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测心肌损伤标志物[心肌肌钙蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）]水平，并用透射电镜观察心肌线粒体超微结构，用免疫印迹法测定线粒体分裂蛋白p-Drp1以及融合蛋白Mfn2的表达。 结果 丹曲胶囊300、600 mg/kg组均能够降低心肌损伤标志物水平（P < 0.01），明显缓解心电图ST段上抬（P < 0.01），并能够减轻心肌细胞线粒体分裂，使线粒体分裂蛋白p-Drp1的表达减少（P < 0.01），而线粒体融合蛋白Mfn2表达差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 丹曲胶囊能够减轻心肌缺血/再灌注损伤，改善心肌缺血状态，减少心肌细胞线粒体的分裂，可能与其抑制线粒体分裂蛋白p-Drp1的表达相关。

[关键词] 丹曲胶囊;心肌缺血/再灌注损伤;线粒体;保护机制

[中图分类号] R542.2;R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2018）12（c）-0016-04

[Abstract] Objective To explore the mitochondrial protective mechanism of Danqu Capsules on myocardial ischemia /reperfusion injury. Methods Thirty healthy male SD rats were divided into 5 groups by random number table method （n = 6）： sham operation group， model group， 300 mg/kg of Danqu Capsules group， 600 mg/kg of Danqu Capsules group， and Isosorbide Mononitrate group （10 mg/kg）. The method of ligation of the left anterior descending branch of coronary artery was used to make model， and the changes of ST segment at different time points of ischemia / reperfusion were recorded. The levels of myocardial injury markers [cardiac troponin T （cTnT）， creatine kinase isoenzyme （CK-MB）] were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method. The ultrastructure of myocardial mitochondria was observed with transmission electron microscope， and the expression of mitochondrial fission protein p-Drp1 and fussion protein Mfn2 was measured by immunoblotting. Results 300， 600 mg/kg of Danqu Capsules groups could reduce the levels of myocardial injury markers （P < 0.01）， relieve the ST segment elevating of ECG （P < 0.01）， reduce mitochondrial fission of myocardial cells and lessen the expression of mitochondrial protein p-Drp1 （P < 0.01）， but there was no significant difference in the expression of mitochondrial fusion protein Mfn2 （P > 0.05）. Conclusion Danqu Capsules can alleviate myocardial ischemia / reperfusion injury， improve myocardial ischemia and reduce mitochondrial fission of myocardial cells， which may be related to the inhibition of the expression of mitochondrial fission protein p-Drp1.

[Key words] Danqu Capsules; Myocardial ischemia / reperfusion injury; Mitochondria; Protective mechanism

心血管疾病已經成为世界公认的健康杀手，而冠脉病变的治疗予以行冠状支架植入术后，存在着心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤，由此造成许多心血管症状，引发一系列心血管事件。中医药治疗MI/R损伤有着很大的优势，天然植物药材的选择以及相对较小的毒副作用是主要原因。丹曲胶囊是陕西省中医医院（以下简称“我院”）心病科研发的院内制剂，已应用于临床。本研究用MI/R损伤动物模型，从线粒体形态和功能角度探讨丹曲胶囊改善MI/R损伤的药效学机制，为丹曲胶囊的临床应用提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物  成年健康雄性SD大鼠30只，1.5～2月龄，体重250～300 g，SPF级饲养条件，饲养条件为恒温（25±2）℃，相对湿度（60±10）%，每日光照12 h，饲养期间大鼠自由摄食、饮水。大鼠均购自第四军医大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（军）字第2007-007号。

1.1.2 药物及试剂  丹曲胶囊购自我院（规格：0.3 g×45粒，批号：20170601）;单硝酸异山梨酯缓释片（山东齐都药业有限公司生产，规格：60 mg×14片，批号：1D1712011）;兔抗p-Drp1（#4494）购自美国CST公司;兔抗Drp1（ab184247）、Mfn2（ab101055）、GAPDH（ab181603）抗体购自英国Abcam公司;心肌肌钙蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒购自南京建成科技有限公司（批号分别为E30062、E30024）。

1.1.3 仪器设备  酶标仪（美国Molecular Devises公司）;多道生理记录仪及分析处理软件（RM-6280）（成都仪器厂）;透射电镜（日本JEOL公司）;电泳系统及凝胶成像系统（美国Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模  各组大鼠术前禁食12 h，不限制饮水，测体重后予以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（1.5 mL/kg），仰卧位固定，予以气管插管，微型动物呼吸机通气，记录Ⅱ导联心电活动，于胸骨左侧4～5肋开胸，暴露心脏后于左心耳下缘处穿线（6/0丝线），结扎冠状动脉左前降支，以直径约0.2 cm塑料管穿过结扎线，以心电ST段明显抬高并与T波融合作为心肌缺血标志。缺血/再灌注时间：缺血30 min，再灌注3 h。

1.2.2 分组及给药  将30只大鼠应用随机数字表法分为假手术组（Sham组）、模型组（MI/R组）、丹曲胶囊300 mg/kg组（DQ300组）、丹曲胶囊600 mg/kg组（DQ600组）、单硝酸异山梨酯组（ISMN组，10 mg/kg），共五组（n = 6）。所有药物剂量依据人与大鼠体表面积换算，ISMN依据成人用量60 mg/d进行换算。Sham组与MI/R组给予同等剂量的生理盐水。手术处理前灌胃2周，术前6 h进行末次给药。

1.3 观察指标

1.3.1 心肌损伤标志物cTnT、CK-MB的检测  于再灌注3 h后，取主动脉血5 mL，室温静置1 h，3000 r/min离心15 min（离心半径为16 cm），留取血清，-20℃冻存。按照使用说明书应用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清cTnT、CK-MB活性。

1.3.2 心电图检测  分别在不同时间节点（结扎冠脉前，结扎后0.5 h，再灌注1、2、3 h）记录心电图，观察Ⅱ导联ST段变化，以游标卡尺记录ST段高度并进行统计分析[1]。

1.3.3 透射电镜观察心肌细胞线粒体形态  术后取出心脏，挤压出残留血液并进行漂洗。剪裁结扎部位旁约2 mm×2 mm长条心肌3块（缺血区域），于2.5%戊二醛固定2 h，PBS漂洗后，放置于1%锇酸固定2 h，接着用PBS漂洗，梯度乙醇脱水处理、浸透，环氧树脂包埋处理。超薄切片机切割后经铀铅等染色处理，置于透射电镜下进行观察心肌线粒体排列分布、大小改变以及结构变化[2]。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western blot）检测p-Drp1、Drp1、Mfn2水平  留取结扎部位旁心肌组织，以组织裂解液加蛋白磷酸酶抑制剂提取蛋白，然后蛋白定量，SDS-PAGE电泳后转膜到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，快速封闭液封闭5 min后，于1∶1000稀释后的抗p-Drp1、Drp1、Mfn2抗体中孵育4℃过夜，常规漂洗后，以二抗室温孵育1 h后洗膜（5 min，5次），曝光显影用Quantity One软件对灰度值进行分析[3]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，方差齐采用LSD法，方差不齐用Dunnett′s-T3法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹曲胶囊对MI/R大鼠血清cTnT、CK-MB水平的影响

与Sham组比较，MI/R组大鼠血清cTnT、CK-MB水平明显升高（P < 0.01）;与MI/R组比较，DQ300组、DQ600组、ISMN组均能够降低血清中cTnT、CK-MB的表达（P < 0.01）;与DQ300组比较，DQ600组的cTnT水平降低（P < 0.01），ISMN组的cTnT、CK-MB水平明显下降（P < 0.01）。见表1。

2.2 丹曲胶囊对MI/R损伤大鼠心电图ST段的影响

与Sham组比较，MI/R组于缺血0.5 h和再灌注1、2、3 h的心电图ST段上抬明显（P < 0.01）;与MI/R组比较，DQ300组、DQ600组、ISMN组均能够降低心电图ST段上抬，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与DQ300组比较，ISMN组能够明显降低心电图ST段上抬，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 丹曲胶囊对MI/R损伤大鼠心肌线粒体形态的影响

Sham组心肌细胞线粒体排列整齐，未见明显异常;MI/R组大鼠心肌细胞线粒体变性明显，呈碎片状分布;DQ600組以及DQ300组线粒体变性减少，碎片化程度下降，此形态改变与ISMN组相似。见图1。

2.4 丹曲膠囊对MI/R损伤Drp1磷酸化水平、Mfn2表达水平的影响

与Sham组比较，MI/R组大鼠心肌的Drp1磷酸化水平升高（P < 0.01）;与MI/R组比较，DQ600组、ISMN组均能够降低Drp1的磷酸化水平（P < 0.01），DQ300组与MI/R组差异无统计学意义（P > 0.05）;与DQ300组比较，ISMN组能够明显降低Drp1的磷酸化水平（P < 0.05）;各组Mfn2表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2、表3。

3 讨论

对于急性心肌梗死，及时地进行冠状动脉介入术或者进行溶栓治疗是有效开通罪犯血管的治疗手段。然而，心肌在缺血后血管再通形成新的平衡会导致再灌注损伤，此种类别的损伤较开通血管前更为严重[4-5]。在MI/R期间，心肌细胞线粒体的功能十分重要，从有氧代谢进入无氧代谢，然后又转复为有氧代谢，这一过程中必然伴随着糖酵解，酸性产物堆积，ATP产能的减少，以及相应的线粒体膜通透孔开放增加，从而损伤超微结构[6-7]。近年来，许多学者对线粒体的动态变化进行了详细的研究，发现线粒体的动力学方式主要是融合和分裂[8]，线粒体功能及其融合分裂动态平衡在心血管保护中十分关键[9-10]。在线粒体动力学的融合分裂中，起主导作用的是线粒体分裂蛋白Drp1以及融合蛋白Mfn2[11-13]。

我们前期临床观察发现[14]，丹曲胶囊对冠心病心绞痛具有显著的改善作用，临床应用于冠心病心绞痛的患者大多效果良好，能够改善患者的症状，降低炎性指标超敏C反应蛋白以及同型半胱氨酸的表达。丹曲胶囊主要有丹参、红曲、银杏叶、三七等中药。现代药理研究表明，丹参素对MI/R具有明显的保护作用，其作用机制可能是通过激活PI3K/Akt和ERK1/2信号通路抑制心肌细胞凋亡，丹参酮ⅡA 亦可以抑制MI/R损伤诱导的氧化应激反应[15-16];红曲含有天然他汀类成分，能够有效地降低血脂，预防动脉粥样硬化斑块形成[17];银杏苦内酯可选择性地抵抗血小板活化因子[18];三七总皂苷具有明显改善MI/R损伤的作用，主要通过抗氧化应激、调节能量代谢、抑制细胞凋亡等途径保护心肌[19]。

基于该复方中药多成分、多靶点的作用特点，本研究应用基础的ELISA以及心电图测定指标，并以透射电镜以及免疫印迹法阐述丹曲胶囊的抗MI/R损伤的线粒体保护机制。目前普遍的共识认为，心肌特异性损伤标志物加上心电图动态改变情况可以较为准确地诊断心肌梗死[20]。本研究结果显示丹曲胶囊能减轻模型大鼠MI/R的心肌损伤标志物水平（cTnT、CK-MB），在MI/R过程中有效减轻心电图ST段上抬，使心肌缺血程度减轻，提示丹曲胶囊能够减轻MI/R损伤。

本研究结果显示，丹曲胶囊能减少MI/R损伤细胞线粒体的分裂，使线粒体分裂蛋白Drp1的磷酸化水平下降，抑制了Drp1的活性，而其对线粒体融合蛋白Mfn2的表达无显著影响，提示在丹曲胶囊抗MI/R损伤的过程中，减少线粒体分裂与调节分裂蛋白Drp1的作用相关联，与调节融合蛋白Mfn2的作用无关。然而，是否存在其他的融合机制参与其中尚待进一步探讨。

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（收稿日期：2018-06-19  本文编辑：张瑜杰）