DNAzymes针对Ezrin mRNA的反义技术靶点筛选及验证

潘辉龙 张国如 王晋 吴兴源

[摘要] 目的 分析肿瘤远处转移相关蛋白（Ezrin mRNA）的结构，寻找并验证DNAzymes作用的最佳靶点。 方法 利用RNAstructure与RNAdraw程序分析Ezrin mRNA结构，计算其一、二级结构，两种程序同时计算出碱基未配对的单链成环区，且连续存在4个以上，则将其设为反义技术的靶区域，在此区域内设计DNAzymes的作用靶点，再依据最低自由能原则，运用计算机中的OligoWalk程序进行筛选，以此方式得到各反义技术的作用靶点，以实验方法验证预测结果。 结果 两种软件预测的共同的单链区共42个，其中完全匹配的单链区21个，编码区具27个。AU1655、AU1751、AU1766、AU1789及GU2623位于连续未配对碱基超过10个的单链区，仅AU1655、AU1751、AU1766、AU1789符合要求。酶切反应结果显示DNAzymes在AU1751位点能够最为理想地切割Ezrin mRNA。结论 相对于传统的单纯依靠实验来寻找靶点，核酸二级结构联合热动力学参数能够更精确、快速地处理靶点的设计和选取问题。AU1751位点相对应的DNAzymes不易形成稳定的自身杂合体，有利于DNAzymes结合RNA。

[关键词] Ezrin;反义技术;靶点;DNAzymes;二级结构

[中图分类号] R73          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2018）12（c）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the structure of distant metastasis associated protein （Ezrin mRNA） and find and verify the best target of DNAzymes. Methods RNAstructure and RNAdraw programs were used to analyze the structure of Ezrin mRNA and calculate its first or secondary structure. If RNAstructure and RNAdraw simultaneously calculate 4 or more unpaired single chain ring forming regions， the single chain ring forming region would be set as the target area of antisense technology for the design of the target of the DNAzymes. Then， according to the principle of minimum free energy， the OligoWalk program was used for screening， and the target of each antisense technology was screened by screening. The experimental method was used to verify the prediction results. Results There were 42 common single chain regions predicted by the two software， of which 21 were single matched， and 27 were coding regions. AU1655， AU1751， AU1766， AU1789 and GU2623 were located in the single chain region over 10 consecutive unpaired bases. Only AU1655， AU1751， AU1766 and AU1789 meet the requirements. The results of enzyme digestion showed that DNAzymes could cut Ezrin mRNA most ideally at AU1751 site. Conclusion Compared with the traditional experiment to find the target， the combined thermal dynamic parameters of the two stage structure of nucleic acid could deal with the design and selection of the target more accurately and quickly. The DNAzymes corresponding to the AU1751 locus is less likely to form stable self heterozygotes， which is beneficial to DNAzymes binding to RNA.

[Key words] Ezrin; Antisense technology; Target; DNAzymes; Secondary structure

Ezrin是一種细胞骨架蛋白，具有连接细胞膜与细胞骨架的功能，属于ERM（Ezrin、Radixin、Moesin）蛋白家族，其作用在于维持细胞正常形态，在细胞一系列生理功能中扮演着重要的角色[1]。大量研究结果表明，Ezrin蛋白在多种恶性肿瘤中都呈现高表达状态[2-5]，且与肿瘤的转移有密切关联[6-7]。因此，将Ezrin蛋白作为靶点进行靶向治疗可能成为恶性肿瘤远处转移的一个新的治疗路径。反义技术建立在碱基互补的基础上，能够使RNA的分子与目的基因特异性结合，令mRNA被切割或降解，使其表达受到抑制[8]。但靶点可能被基因的二级结构所隐藏，因而限制了反义技术的应用。最常用的反义技术之一为DNAzymes，是一种人工合成的单链的小DNA分子，可以在特定位点对RNA分子进行切割，从而下调相关基因和蛋白的表达。本研究联合核酸二级结构和热动力学参数来综合预测DNAzymes的作用位点，以探求一种合理的设计方式使反义技术能够运用于Ezrin。

1 对象与方法

1.1 研究对象

自GenBank数据库筛选出编码为X51521.1的人类Ezrin蛋白mRNA全长序列，在其中获取3044个碱基编码Ezrin蛋白的基因。通过RNAstructure与RNAdraw程序分析Ezrin mRNA结构，分析计算其一、二级结构的相关信息。两种程序同时计算出碱基未配对的单链成环区，且连续存在4个以上，则将其设为反义技术的靶区域，在此区域内设计DNAzymes的作用靶点，再依据最低自由能原则，运用计算机中的OligoWalk程序进行筛选，以此方式得到各反义技术的作用靶点，筛选结果为AU1655、AU1751、AU1766以及AU1789。

1.2 细胞培养及DNAzymes合成

人成骨肉瘤耐药细胞系MG63/DOX（100万细胞数）购买自上海酶研生物公司，将细胞置于DMEM培养液中，加入10%小牛血清，37℃培养使其贴壁生长，每隔6 h观察1次，至细胞90%融合后，取出，严格按照说明书提取RNA。Trizol总RNA抽提试剂盒购自上海沪峰化工有限公司。DNAzymes委托上海生工公司合成。与RNA提取试剂盒提取总RNA后，用紫外分光光度仪测定浓度与质量，行逆转录生成cDNA，并以cDNA作为模板进行扩增。以Ezrin编码区1761 bp作为底物进行扩增，将扩增后的产物再作为模板进行体外转录，并克隆入T-tailed载体中合成质粒并测序。根据筛选出的AU1655、AU1751、AU1766以及AU1789四个切割位点分别合成相应的DNAzymes。在体外，采用DNAzymes鉴定EzrincRNA的酶切反应与底物。

1.3 EzrinmRNA一、二级结构与热动力学的分析及预测

用软件RNAdraw和RNAstructure分析EzrinmRNA全长序列以及其一、二级结构，同时检测Ezrin mRNA一级结构内碱基数量及含量、37℃时EzrinmRNA的二级结构[10]。将两种软件计算出RNA二级结构中共同的单链区，若在连续4个以上出现没有配对的碱基区域，则将其设计作为DNAzymes的作用的靶点。用核酸热动力学软件OligoWalk对DNAzymes和EzrinmRNA作用位点结合后形成的杂合体进行热稳定性计算[11-12]。

2 结果

2.1 EzrinmRNA结构预测

两种软件预测的共同的单链区共42个，其中完全匹配的单链区21个，编码区具有27个。42个单链区的18个AU和GU位点被挑选作为DNAzymes的作用位点，其中12个在编码区。见表2。

2.2 EzrinmRNA切割位点的筛选

OligoWalk软件被用于计算DNAzymes和EzrinmRNA作用位点结合后的热稳定性，18个AU或GU位点的GBreak-targ、Goverall、Goligo-oligo和Goligo-self，见表2。依据筛选标准，仅AU1655、AU1751、AU1766、AU1789符合要求。该4个位点与所在的Ezrin mRNA二级结构关系密切，且均集中位于A1654-A1797编码区，见图1，可见有效的DNAzymes作用位点相对集中在特定区域。

2.3 酶切反应结果

酶切反应结果显示，在预期位点成功切割Ezrin全长mRNA的只有AU1751相对应的DNAzymes，经反应后可见，AU1751位点所剩的底物最少。且此位点相对应的DNAzymes，其△Goligo-oligo为0 kcal/mol，高于其他DNAzymes。

3 讨论

导致恶性肿瘤患者的预后较差及患者死亡的主要因素是肿瘤的远处转移，Ezrin蛋白已被证实在骨肉瘤[13-14]等恶性肿瘤中扮演者重要角色。

反义技术作为基因治疗的方式之一，近年来得到了较快的发展，其中最常见的为DNAzymes反义技术，其具有广阔的应用前景。有研究[15]表明位点是否被隐藏，严重影响着反义技术的应用。虽然DNAzymes的位点被认为与其他反义技术相似，但目前尚缺乏直接的研究证据支持，因此，高效的选择DNAzymes对于其靶基因的作用点具有重要的研究意义。

在影响反义技术效果的因素中，靶基因的二级结构起着至关重要的作用。鉴于RNA的潜在二级结构可能阻碍DNAzymes与靶基因结合的。反义分子与靶基因在二级结构最简单的区域结合最为牢固，因此研究者选择作用位点时，单链区比双链区有更大的优势[16]，高活性的反义分子作用位点被认为存在于mRNA中未形成二级结构的区域内[17]，反义技术的作用位点是否因为二级结构而被隐藏，与靶基因的单链区密切相关。对兔β-globinmRNA进行研究的结果证实了单链区对作用位点是否可及具有具有决定作用[18]。有研究提出DNAzymes的切割位點至少应该存在连续4个以上未配对的碱基成环区[19]，超过10个碱基连续未配对区对于选择反义分子作用位点是更为理想的区域。

由于mRNA存在二级结构，掩盖了相当部分的DNAzymes作用位点，因此不能成功结合反义分子，难以发挥作用下调金银的表达，因此本研究目的不仅在于筛选租用位点，还需要对其进行实验验证。通过软件计算，本研究得到了4个作用位点，每个位点均在连续10个以上未成对碱基形成的环状区，其中AU1751位点相应的DNAzymes能够成功切割EzrinmRNA，得到的片段与预期相符合。

DNAzymes和底物相互作用后，形成杂合体的热动力学也影响着eDNAzymes对EzrinmRNA的切割。杂合体的热稳定性不仅与RNA杂合区域结构有关，也与反义分子结构的热稳定性有关。本研究将Goverall（-25.0 kcal/mol）设定为为评估标准，用以评价DNAzymes和靶基因杂交热稳定性，最终选出的4个位点均集中位于A1654～A1797编码区，可见有效的DNAzymes其作用位点倾向于在某一个特定的区域相对集中。酶切反应结果显示，在预期位点成功切割Ezrin全长mRNA的只有AU1751相对应的DNAzymes，经反应后可见，AU1751位点所剩的底物最少，说明DNAzymes在AU1751位点能够最为理想地切割Ezrin mRNA。且此位点相对应的DNAzymes，其△Goligo-oligo为0 kcal/mol，高于其他DNAzymes，可见另外三个位点的DNAzymes可能形成自身杂合体，且较为稳定，不利于DNAzymes结合RNA。推测DNAzymes与靶基因杂交时，△Goligo-oligo可用于预测其热动力学参数。

另外，盡管RNA二级结构在反义技术中起至关重要的作用，但核酸三级结构也可能影响RNA与蛋白质之间的作用，限制其预测价值，因此，多种方法预测作用位点有其必要性。本研究通过体外实验进行了预测所得位点的验证，但将其应用到肿瘤的治疗中，还需要进一步进行体内实验，以明确其应用前景。

综上所述，应用计算机程序预测与筛选针对EzrinmRNA的DNAzymes作用位点，相对于单纯实验方式，更为精确与快速、高效，将实验与计算机技术联合在一起，联合多学科进行研究，有利于更大限度发挥反义技术的靶向治疗作用。

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（收稿日期：2018-06-05  本文編辑：任   念）