三七川归颗粒水溶性成分提取及成型工艺研究

王萍萍张 浩

（1 威海市中心医院门诊药剂科，山东 威海 264400；2 长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117）

三七川归镇痛颗粒由三七、川芎、当归、藿香、甘草五味药材组成，具有活血化瘀、消炎止痛、调节免疫等功效，临床可用于治疗妇女月经不调、痛经等症。

在前期的研究过程中我们已经完成了对方中脂溶性成分提取工艺的摸索，并确定了最佳提取工艺。川芎、当归为方中臣药，二者共有的主要成分为阿魏酸。阿魏酸(ferulic acid)化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，分子式为C10H10O4，易溶于热水、乙醇、乙酸乙脂等[1-5]，是该处方发挥消炎镇痛作用的主要水溶性成分。

综合前期药理学实验结果，为充分提取处方中药材的有效成分，拟采用煎煮法对药方中水溶性成分进行提取。本试验以阿魏酸的含量为指标，采用L9(34)正交试验法对方中药材的水溶性成分最佳提取工艺进行筛选，并用药材提取物进行颗粒剂成型工艺的研究。

1 材料

1.1 仪器 电热数码恒温水浴锅（金坛市电热仪器厂）；BP211D电子分析天平（上海精密仪器厂）；LXJ-IIB型离心机（上海安宁科学仪器厂）；UV-935型紫外可见分光光度计（大连依利特仪器公司）；DZF-6050型真空干燥箱（天津泰斯特仪器分公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；岛津液相色谱仪（日本岛津制作所）；Mini-CG型湿法混合快速制粒机（创志机电科技发展股份有限公司）。

1.2 试剂 本实验所用药材均购于黑龙江千草药业股份有限公司；阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院）；色谱甲醇（美国Fisher公司）；色谱乙腈（美国Fisher公司）；盐酸，磷酸，乙醚均为分析纯（北京化工有限公司）；硅藻土（天津康达精细化工有限公司）；碳酸钠（上海精细化工责任有限公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

为了最大可能提出处方中药材的有效成分，乙醇提取后的药渣需要与川芎、当归二药合并，继续进行水煎操作。

2.1 阿魏酸含量测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备精密称量阿魏酸对照品1.4700mg，置250 mL量瓶中，加85%乙醇使溶解，稀释至刻度，用微孔滤膜 （0.22 μm） 滤过，滤液另器保存，备用[6-10]。2.1.2供试品溶液的制备 取供试品约1.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入4.5 g硅藻土和70 mL纯化水，超声处理15 min，离心25 min（2500 r/min），取上清液35 mL置于分液漏斗中，用稀盐酸调节pH=2.5～3.5，用乙醚20 mL，萃取3次，分层，合并乙醚层，用5%Na2CO3溶液萃取3次，每次50 mL，合并水层，稀盐酸调节pH=2.5～3.5，用乙醚45 ml萃取3次，合并乙醚层，挥去溶剂，残渣用85%乙醇适量使溶解，定容至10 mL，以微孔滤膜滤过 （0.22 μm），即得[6-10]。

2.1.3 测定波长的选择 取阿魏酸对照品溶液，稀释到适宜浓度，在290～530 nm波长范围进行扫描，结果见图1。

图1 阿魏酸对照品紫外扫描图

图1结果显示，阿魏酸对照品在315 nm处有最大吸收，结合文献报道，确定最大波长为315 nm。2.1.4色谱条件 色谱柱为Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μL）；检测器为紫外检测器流动相为 A（79.9%）：水-磷酸二氢钾-庚烷磺酸钠，B（20.1%）：乙腈；柱度为30℃；流速为1 mL/min；检测波长为315 nm。2.1.5系统适应性试验 取阿魏酸对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，结果见图2。

图2 对照品（a）和供试品（b）高效液相色谱图

图2结果表明，供试品中阿魏酸色谱峰与其他色谱峰可以较好分离，其出峰时间与对照品一致。

2.1.6 方法学考察

2.1.6.1 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液3 μL，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL进样，记录峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=5023.9+1521.7X，R2=0.9997。见表1及图3。

表1 阿魏酸对照品标准曲线数据表

图3 阿魏酸对照品线性关系曲线

结果表明，阿魏酸的含量在3.75～25.00 μg范围内，线性关系良好。

2.1.6.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按色谱条件连续进样5次，测定峰面积，结果表明阿魏酸对照品溶液的RSD值为1.94%，证明仪器和所建立的分析精密度良好。

2.1.6.3 重复性试验 分别取同一批样品5份，按照“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，按色谱条件进样5次，测定峰面积，结果表明其RSD值为2.26%，证明所建立的试验方法重复性良好。

2.1.6.4 稳定性试验 取供试品溶液，在室温条件下放置，分别在第0、4、8、12、24 h取样，依法测定峰面积，结果表明其RSD值为1.72%，证明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.1.6.5 回收率试验 精密吸取已知含量的供试品溶液5份，精密加入对照品0.013 mg，测定峰面积，计算含量，结果表明，平均回收率为97.23%，RSD值为2.15%，表明此方法可行。

2.2 水提工艺的考察 根据文献报道及预试验结果分析，影响该处方水提工艺的主要因素有加水倍量、提取时间和提取次数，因此我们分别考察这3个因素，确定其水平范围。

2.2.1 药材吸水率的考察 加水量是影响药材提取效率的主要因素之一，为了使加水量更加准确，需要对药材的吸水率进行测定。

按处方比例将二氧化碳超临界及乙醇提取后的药渣与川芎、当归等药材混合，共三份，每份120 g，加1000 mL水浸泡至药材无白芯，滤出全部未被吸收的水液，称量体积，计算吸水量，求得药材的吸水率，结果见表2。

表2 药材吸水率考察

表2结果显示，药材的吸水率约为215%。

2.2.2 正交实验因素水平的确定 根据吸水率测定结果，药材吸水率在2倍以上，根据工厂生产经验，选择加水量为10、12、14倍量；根据药厂一般生产情况，确定煎煮时间分别为1、1.5、2 h，确定煎煮次数分别为1、2、3次。

2.2.3 正交试验 采用L9(34)正交试验法，以提取物中目标物质阿魏酸的含量为考核指标，分别称取处方量药材9份，按表3中的因素水平设计提取试验，滤过，合并滤液，浓缩，干燥至恒重，依法测干膏中阿魏酸的含量，结果见表4。

表3 正交试验因素水平表

表4 正交试验表与结果

表5 正交试验方差分析表

以上试验结果显示，以干膏中阿魏酸为评价指标，影响水提工艺因素作用的顺序为煎煮次数＞加水量＞煎煮时间，其中加水量与煎煮次数的影响具有显著性差异。综合考虑，确定最佳水提工艺是A3B1C3，即加入12倍量于药材质量的水，煎煮3次，每次1.0 h。

2.2.4 验证试验 取10倍于处方量的药材，共3份，分别加水12倍量加热提取3次，每次1.0 h，滤过，浓缩，干燥至恒重，测定阿魏酸含量，结果提取物中阿魏酸的含量分别为0.4570 mg/g、0.4625 mg/g和0.4545 mg/g，RSD小于2%，证明此工艺稳定可行。2.3颗粒成型工艺研究

2.3.1 稀释剂加入量的考察 复方镇痛颗粒的脂溶性和水溶性提取物混合后颜色为棕黑色，药物颜色虽然与药效无关，但可能会影响患者的顺应性，因此考虑在提取物中加一定量着色剂或稀释剂调整颜色。考虑到提取物本身的颜色很深，用着色剂可能不好调整，因此先采用加稀释剂的方式对颜色进行调整。

按生药量折算脂溶性和水溶性提取物的质量，粉碎后过80目筛，按质量比加入不同质量的淀粉，混合均匀，平铺于白纸上，观察[11-15]。结果见表6。

专业人才在供需结构及其数量上的不平衡是造成医学教育管理常见问题最主要的缘由。产业结构的调整以及经济增长方式的不断转变对于该专业学科的毕业生来说，社会上的供给结构和数量在不同的阶段有着不同的要求，随着产业的调整和市场经济的增长方式的转变会直接要求各大高校对于人才供给的调整快速采取行动。然而，医学院校继续医学教育专业设置比较稳定，而且专业人才的培养需要一定的周期，这样很容易出现社会上相关专业人才供需不平衡的问题出现，直接会导致高校医学教育管理常见问题的出现。

表6 稀释剂的选择

表6结果表明，含30%淀粉时颗粒颜色最好。

2.3.2 甜味剂加入量的考察 药物提取物本身极苦，直接制剂必然影响患者口服时的口感，需要加入一定量甜味剂进行矫味。考虑到糖尿病患者的需求，拟选择蛋白糖作为甜味剂。

取药材提取物，粉碎后过80目筛，加入30%淀粉混合均匀，等比例分成5份，按表格中比例加入甜味剂，混合均匀，品尝[11-15]。结果见表7。

表7 矫味剂的选择

表7结果表明，5.0%时口感较好。

2.3.3 润湿剂的考察 药物提取物具有较大的粘性，不能用纯水作为润湿剂，因此考察不同浓度乙醇对制粒效果的影响。

取药材提取物适量，粉碎后过80目筛，加入30%淀粉和5%蛋白糖混合均匀，等比例分成5份，分别加入不同浓度乙醇适量，制软材，过30目筛制颗粒，观察颗粒性质[11-15]。结果见表8。

表8 润湿剂的选择

表8结果表明，用60%乙醇作为润湿剂较为合适。2.4颗粒剂的小试放大 取药材提取物约200 g，置湿法制粒机中，加30%淀粉和5%蛋白糖混合，加60%乙醇适量，制软材，用摇摆式制粒机过30目筛制颗粒，用流化床干燥至颗粒水分小于3%，即得。

2.6 流动性的考察 采用固定圆锥槽法：取漏斗固定于水平放置的坐标纸上方适宜高度处，使漏斗下口距坐标纸的距离为H；取制备好的颗粒适量，沿漏斗壁缓慢倒入漏斗中，直到颗粒的圆锥体尖端接触到漏斗口为止，此时由坐标纸测出圆锥体底部的半径R，计算出休止角 (tgα=H/R)，重复测定3次[11-15]。

结果颗粒剂的平均休止角约为30°，证明自制颗粒剂流动性良好。

2.7 临界相对湿度的测定 取颗粒约1 g，共7份，分别置已称重的称量瓶中，精密称定，将称量瓶瓶盖打开，分别放入湿度表格中环境中，25℃恒温放置24 h，取出，加盖后精密称定，计算吸湿百分率[11-15]。

表9 临界相对湿度的考察结果

结果表明，颗粒剂在湿度超过58%之后吸湿性明显增加，判断颗粒剂的临界相对湿度约为60%，因此在生产过程中环境湿度至少要低于60%。

3 讨论

试验中阿魏酸含量测定是在315 nm波长处进行的。根据文献报道，阿魏酸在286 nm和215 nm处也有吸收，对此我们进行了波长扫描，结果显示阿魏酸在315 nm处吸收值为最大。

颗粒剂是一种中间剂型，根据原处方生药量折算，提取物服用量约为3.5 g，服药量不算大，可以进一步将其制备成胶囊剂或者片剂，发挥其可以根据病情轻重增减药量的优势。

本处方原工艺是将所有药材经水煎煮、滤过，滤液浓缩后经相应处理制备成大蜜丸给患者服用；经前期药理学实验表明，部分药材的醇提物与水提物混合后的混合物比全部药材的水提物镇痛作用强很多，证明原提取工艺无法提取出药材中具有镇痛效果的脂溶性成分，而现在的提取工艺更完整地保留了处方中的活性成分，更有利于药学的发挥。

研究中是选用脂溶性和水溶性中最主要的活性成分的含量作为考核指标进行了提取工艺的筛选，但一个复方药效的发挥不仅仅与这些主要活性成分有关系，具体与哪些成分的含量或者与哪些成分的组合有关，还需要进行深入细致的研究。

[1]赵鑫华.加味消炎止痛方的药理作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理，2008，19(1)：77-79.

[2]张翠英，章洪，戚琼华.川芎的有效成分及药理研究进展[J].辽宁中医杂志，2014，41(10)：2264-2266.

[3]张焕，王一涛，严灿，等.当归与川芎药理作用研究进展与比较[J].时珍国医国药，2008，19（2）：293.

[4]张翠英，章烘，董宇，等.基于药效成分丹酚酸B和阿魏酸在大鼠血浆的药代动力学研究丹参与川芎配伍[J].中国中药杂志，2015，40（8）：1589-1593.

[5]高秀艳，宋士军，崔同，等.阿魏酸对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用及其机制[J].郑州大学学报：医学版，2013，48（4）：459.

[6]潘明凤.川芎的化学成分研究与多指标成分的含量测定[D].成都：西南交通大学，2014.

[7]冯敬骞，杨义芳.当归、川芎及其药对的超临界提取物的GC-MS成分分析[J].中国医药工业杂志，2009，40（10）：754-757.

[8]吕光华，程世琼，陈金泉，等.HPLC测定川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量及其质量评价指标[J].中国中药杂志，2010，35（2）：194-198.

[9]HPLC同时测定川芎、当归SFE-CO2萃取物中7种成分含量及阿魏酸松柏酯稳定性考察[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（9）：24-29.

[10]项妤，张贵君，甘德全.HPLC测定CO2超临界萃取的当归油药效组分[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：64-67.

[11]张荷兰，陆鸿奎，王春光，等.复方翻白草颗粒剂的制备工艺研究[J].中国药房，2016，27（10）：1392-1395.

[12]严云良，戴晓燕，吴巧凤，等.4种中药颗粒剂吸湿过程的数学模型应用研究[J].中华中医药杂志，2012，27（11）：2963-2965.

[13]沈涛，李季文，梁海宁，等.多指标优选益气固本颗粒澄清工艺[J].中国药房，2016，27（1）：76-79.

[14]文谨，刘起华.参柏颗粒两种制粒工艺的比较研究[J].中成药，2011，33（9）：1615-1617.

[15]张兆旺.中药药剂学[M].北京：中国中医药出版社，2003：394.

[16]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015.