牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿亚基不同组合融合抗原对BALB/c小鼠免疫保护性实验

布日额，王金良，吴金花，锡林高娃，陈金龙，孙立杰，王 华

(1.内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心，内蒙古 通辽028043；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600；3.内蒙古民族大学 生命科学学院，内蒙古 通辽028043；4.内蒙古民族大学 乳源性致病菌研究所，内蒙古 通辽028043；5.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州256600)

奶牛隐性乳腺炎(Bovine mastitis，BM)是危害奶牛乳腺健康的主要疾病之一，该病不仅造成奶牛产奶量的下降，更引起牛奶质量的大幅度降低。针对临床型BM通常的治疗方法是利用抗生素，但已造成许多具有广谱抗药性的乳腺炎无乳链球菌不断被报道[1-2]，而且牛奶中抗生素残留对人类健康也造成不良影响。

无乳链球菌属B群链球菌(Group BStreptococcus agalactea，GBS)，是引起BM的重要致病菌，该菌也对婴幼儿危害严重，给人畜公共卫生安全带来极大的隐患[3-4]。传统的乳腺炎疫苗多为全菌灭活苗或者减毒活疫苗，全菌灭活苗中抗原成分复杂，具有较大的毒性，而且免疫效果欠佳；而乳腺炎减毒活疫苗临床很容易出现毒力返强而引起发病。基因工程亚单位疫苗与传统疫苗相比克服了以上缺点，具有安全性好和纯度高的优点，因此研究乳腺炎主要致病菌的重组基因工程亚单位疫苗具有广阔的应用前景。无乳链球菌具有类似大肠杆菌的菌毛样结构，菌毛骨架蛋白(Bone protein,BP)、辅助蛋白1(Anciliary protein 1，AP1)和AP2，是编码菌毛岛屿的3个有效保守性抗原组分，具有良好的抗原性及一定的免疫保护性，本研究在前期研究的基础上将不同组合的菌毛岛屿融合蛋白AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2及AP1-BP-AP2对小鼠进行免疫保护实验，以筛选和明确最佳抗原组合方式，为研发有效的基因工程乳腺炎疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、实验动物及主要试剂 临床分离Ia型致病性无乳链球菌(ID50为104cfu/mL)，AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合纯化抗原为内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心构建备存[5-7]；100只BALB/c小鼠由山东中医药大学实验动物室提供，SCXK(鲁)20110003；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、羊抗鼠IgG-HRP为北京中生瑞泰科技有限公司产品。

1.2 不同融合抗原免疫制剂的制备 采用BCA法检测AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合纯化抗原浓度并准确稀释至2.0 mg/mL，参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》，将不同融合抗原与同体积的弗氏佐剂进行乳化(包括完全佐剂与不完全佐剂)，制备AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合抗原免疫制剂，经检测无菌后经皮下注射BALB/c小鼠(0.5 mL/只)观察2周无异常状况后4℃冰箱保存备用。

1.3 小鼠分组及免疫程序 取30只小鼠，每只小鼠于实验第0、7 d、14 d、28 d皮下注射AP1-AP2融合抗原免疫制剂50μL(抗原含量为50μg)，每次免疫前及首免后第35 d、42 d、49 d随机采血制备血清。AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合抗原制剂的免疫操作同AP1-AP2融合抗原免疫制剂。对照组以生理盐水代替融合抗原免疫制剂进行试验，每只小鼠注射50μL生理盐水，具体操作同实验组。

1.4 小鼠免疫血清抗体水平检测 以纯化的AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融 合 抗原作为包被抗原，通过方阵滴定法优化了每种抗原ELISA最佳工作条件，建立检测免疫抗体水平的间接ELISA方法，免疫前制备的24份小鼠阴性血清用于临界值确定，以第0、7 d、14 d、28 d、35 d、42 d、49 d采集的血清为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP抗体为二抗，利用该ELISA方法检测免疫抗体水平与最终效价，分析抗体消长规律，并评估哪种融合抗原免疫后的抗体效价为最佳。

1.5 免疫保护试验 于免疫后第50 d，从4个实验组分别各取20只小鼠，从对照组取20只小鼠进行攻毒试验。以0.5 mL/只小鼠腹腔注射Ia型致病性无乳链球菌(2×104cfu/mL)，连续观察7 d小鼠状况，统计每组小鼠的发病率P(P=每组发病小鼠数量/每组小鼠总数×100 %)，计算免疫保护指数PI，PI=(攻毒对照组发病率-融合抗原免疫组发病率)/攻毒对照组发病率×100 %。

2 结果

2.1 小鼠免疫血清抗体水平及效价检测

2.1.1 小鼠抗体水平的ELISA检测方法的建立经优化后每种抗原的最佳工作浓度均为5.0μg/mL，最佳工作条件为4℃12 h；以10 %小牛血清为封闭液，于37℃最佳封闭时间为2 h；样本血清最佳稀释度为1∶100倍，37℃最佳作用时间为1 h；酶标抗体最佳稀释倍数1∶4 000倍，37℃最佳作用时间为1 h；TMB为底物显色液，室温显色时间为15 min。

用以上检测条件使用AP1-AP2包被板对24份小鼠的阴性血清进行检测，收集数据经计算阴性血清OD450nm平 均 值X=0.2320，标 准 方 差SD为0.03426，临界值为X+3SD，即当OD450nm值≥0.3348判为阳性。以该方法对AP1-AP2抗原免疫组免疫后第0、7 d、14 d、28 d、35 d、42 d、49 d采集的血清进行抗体水平检测。以同样的方法计算AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合抗原ELISA检测方法的临界值分别为0.3445、0.3389和0.3317。

2.1.2 小鼠抗体水平检测AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2 4种融合抗原分别经4次免疫小鼠后，利用上述ELISA方法检测结果显示，各组小鼠均产生了较高水平的抗体，其中AP1-BP-AP2融合抗原产生的抗体水平为最高(图1)。表明AP1-BP-AP2融合抗原更容易刺激机体产生抗体。

图1 4种融合抗原诱导小鼠抗体水平检测Fig.1 Detection of antibody levels in the mice immunized by four kinds of fusion antigens

2.1.3 融合蛋白免疫组小鼠抗体效价检测经过4次免疫小鼠后35 d及49 d AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2融合抗原产生的抗体效价经检测，结果显示均为1∶12 800，AP1-BP-AP2融合抗原产生的血清抗体效价为1∶25 600(图2)，相同免疫条件下AP1-BPAP2融合抗原刺激小鼠产生抗体效价高于AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2融合抗原，表明该组合融合抗原的抗原性为最佳。

图2 间接ELISA检测AP1-AP2(A)、AP1-BP(B)、BP-AP2(C)及AP1-BP-AP2(D)血清抗体效价Fig.2 Detection of AP1-AP2(A),AP1-BP(B),BP-AP2(C)and AP1-BP-AP2(D)serum antibody titer by indirect ELISA

2.2 免疫保护试验 免疫后第50 d攻毒，发病小鼠出现精神沉郁、扎堆、不喜欢运动、饮食减少甚至绝食现象。攻毒48 h后各组小鼠发病数量达到最高，抗原免疫组小鼠发病数量明显低于攻毒对照组，计算每组小鼠的免疫保护指数PI结果显示，4种重组抗原对小鼠均有一定的免疫保护性，其中以AP1-BP-AP2重组抗原对小鼠的免疫保护效果最佳，其免疫保护指数PI达到80 %(表1)。表明AP1-BPAP2重组抗原可以作为牛乳腺炎无乳链球菌亚单位疫苗的候选抗原。

表1 小鼠的免疫攻毒试验Table 1 The protection of the immunized mice against challenging with S.agalactiae

3 讨论

细菌菌毛(pili)是大肠杆菌等许多革兰氏阴性菌及牛棒状杆菌等少数革兰氏阳性菌菌体表面的附属结构，是与细菌的黏附、侵袭力密切相关的重要致病因子，具有良好的抗原性[8]。近年来发现无乳链球菌也具有类大肠杆菌的菌毛样结构，国内外学者针对无乳链球菌菌毛开展了一些相关研究[9]。Rosini等对装配菌毛蛋白的菌毛岛屿基因组结构特征进行了深入的描述，并指出菌毛状结构是无乳链球菌重要的毒力因子和潜在的候选疫苗抗原靶位[10]。Konto-Ghiorghi等的研究也证实，无乳链球菌菌毛在黏附组织上皮细胞及无乳链球菌生物被膜的形成中发挥重要作用[11]。Khare等对菌毛基因的表达与信号调节进行研究，结果证实无乳链球菌菌毛在装配过程中需要一种叫Sortase的转肽酶，这种酶存在两种形式Srt A和Srt C，Srt A参与催化菌毛的装配聚合，Srt C参与细胞壁聚合物锚固菌毛[12]。Sharma等研究报道显示，菌毛蛋白的特异性血清可以抑制88%以上的肺上皮巨噬细胞感染VII型无乳链球菌[13]。这些成果为无乳链球菌的菌毛亚单位疫苗研究提供了理论支持。另有国外研究报道显示，无乳链球菌分离菌株中至少存在一种菌毛结构基因，并证实有两种菌毛岛屿，分别是PI-1和PI-2，在PI-2中有PI-2a和PI-2b两种，而PI-2a菌毛岛屿检出比例高达79%，其次为PI-1菌毛岛屿，所占比例为70%[14]。

本研究利用前期构建的PI-2a菌毛岛屿骨架蛋白BP、辅助蛋白AP1、AP2的抗原优势区融合蛋白AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2免疫小鼠后均产生了不同程度的抗体水平，其中免疫AP1-BP-AP2融合抗原小鼠产生的抗体效价最高，在免疫后49 d达到1∶25 600，其免疫保护指数PI达到80%，显示出良好的免疫保护效果。本研究首次明确了基于菌毛岛屿亚基基因构建的AP1-BP-AP2融合抗原可以作为无乳链球菌的菌毛亚单位抗原，为进一步开发防控无乳链球菌性牛乳腺炎的亚单位疫苗及其流行病学检测试剂盒奠定了坚实的研究基础。