质粒介导的氟喹诺酮外排泵基因qepA的研究进展

何 英，李九彬，王豪举*，丁红雷*

(1.西南大学 兽医传染病学实验室，重庆 北碚400715；2.西南大学附属中学，重庆 北碚400700)

二十世纪八十年代以来，氟喹诺酮类药物开始大规模用于治疗人和动物的细菌疾病，且作为细菌疾病的预防药物广泛用于水产业和畜牧业中[1-2]。第一代喹诺酮药物是萘啶酸(Nalidixic acid)，后来喹诺酮分子主链的第8位C原子被N原子取代，并在第6位添加F原子，使它具有更有效的抗菌作用和更广泛的活性。氟喹诺酮药物具有针对真核靶标的活性，且有研究称它可作为新型的抗寄生虫治疗药物或抗肿瘤药物[3]。但部分氟喹诺酮药物也存在一定的副作用，有时甚至会造成死亡。研究结果显示，近年来从临床材料和食品中分离的沙门氏菌对环丙沙星的耐药率均有显著增加[4]。随着氟喹诺酮药物的大量使用甚至滥用，氟喹诺酮耐药现象在人类临床及兽医实践中日益凸显，在国内外均有广泛报道，尤其是多重耐药性。

1998年从病人尿液分离出一株多重耐药的肺炎克雷伯氏菌，在该菌中发现第一个质粒介导的氟喹诺酮耐药(Plasmid-mediated fluoroquinolone resistance，PMQR)基 因qnrA。截至目前共发现4类PMQR蛋白：重复五肽家族成员Qnr蛋白、氨基糖苷乙酰转移酶Aac(6')-Ib-cr以及两个外排泵蛋白OqxAB和QepA[5]。虽然PMQR蛋白只能介导细菌对氟喹诺酮类药物的低水平耐药，但增加了细菌中氟喹诺酮耐药决定区DNA解旋酶(DNA gyrase)和拓扑异构酶Ⅳ(Topoisomerase IV)的突变几率，使由染色体介导的氟喹诺酮类药物的高水平耐药几率显著增加[6]。因此PMQR基因在氟喹诺酮耐药性的传播中起着重要作用，并在人与动物病原菌中大范围流行，越来越引起人们的重视。

qepA基因是近10年来新发现的一个PMQR基因，其与亲水性氟喹诺酮类药物如诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的耐药性相关[7-8]，且常与其它质粒介导的氟喹诺酮耐药基因、氨基糖苷类耐药基因rmtB[9-10]和/或β-内酰胺类耐药基因[11]一起在同种和不同种菌株间水平转移，导致细菌的多重耐药。携带qepA基因的耐药菌株常与养殖场环境相联系，这与氟喹诺酮药物在畜牧和水产行业中大量使用甚至滥用有关。qepA等位基因发现的速度非常快，截至目前共发现其4个等位基因：qepA1、qepA2、qepA3和qepA4。本文对氟喹诺酮类药物耐药机制及qepA基因的类型与分子特征进行综述，同时总结其近年来在国内外的流行情况，以期为人和动物的合理用药提供参考。

1 氟喹诺酮耐药机制

与qepA基因相关的氟喹诺酮耐药机制主要包括位点突变和药物外排两个方面[5,12]。氟喹诺酮类药物是广谱抗菌药物，抑制细菌DNA在细胞分裂期间的释放和复制。在原核生物和真核生物中，氟喹诺酮类药物是DNA复制过程中Ⅱ型拓扑异构酶(Topoisomerase II)的有效抑制剂。在不同细菌中，氟喹诺酮药物与Ⅱ型拓扑异构酶优先结合的位点不同，在革兰氏阴性菌中优先结合DNA解旋酶，而在革兰氏阳性菌中则优先结合拓扑异构酶Ⅳ。当优先结合位点发生突变后，氟喹诺酮药物也会与第二位点结合而发挥抗菌活性[12]。氟喹诺酮药物与DNA解旋酶的GyrA亚单位或拓扑异构酶Ⅳ的ParC亚单位的第4个螺旋结合后，再与细菌DNA结合形成药物-酶-DNA三元复合物，使Ⅱ型拓扑异构酶不能直接与DNA结合发挥作用而达到抑菌或杀菌效果[5,12]。氟喹诺酮药物发挥作用的两个途径是蛋白合成依赖途径(The protein synthesis-dependent pathway)和蛋白合成非依赖途径(The protein synthesis-independent pathway)，蛋白合成依赖途径又称氯霉素敏感途径，因为氯霉素能够抑制氟喹诺酮药物介导的细胞死亡过程[5]。QepA蛋白的存在增加了DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的突变几率，发生突变以后便不能形成药物-酶-DNA三元复合物而使氟喹诺酮药物不表现出抑菌效果[5,8,12]。

外排泵是一种成熟的氟喹诺酮类耐药机制，它能将细胞质和细胞膜所不需要的物质(如氟喹诺酮药物)排出体外。不同的外排泵能够泵出具有不同亲和力的氟喹诺酮药物，以不同的方式影响最终的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。主要协助转运蛋白超家族(Major facilitator super family，MFS)是外排泵中最大最多样化的家族之一。位于细胞内膜的MFS蛋白具有相似的结构和反应过程，其由14个跨膜螺旋(Transmembrane helices，TMHs)构成两个结构域[13-14]。氟喹诺酮药物可以与MFS蛋白及质子结合形成药物-MFS蛋白-质子三元复合物，且由电化学质子梯度提供动力来控制反应速率，使药物从细胞质和细胞内膜通过磷脂双分子层，随后由MFS蛋白去质子化，药物排出到细胞外，而使细菌对药物的敏感性降低[13](图1)。不同的MFS蛋白其三元复合物结合的顺序不同，药物与质子交换的化学计量单位也不同[13]。在外排的过程中MFS蛋白的药物结合位点处于向内开放状态和向外开放状态的构象转换中，从而达到转运药物的作用[13-14]。QepA蛋白有14个TMHs、7个特别的基序，其TMH14的位置与MFS蛋白中质子依赖型外排泵相似，N、C末端位于细胞质中，转座酶共有序列基序A位于TMH2和TMH3之间的环中，药物外排共有序列基序C位于TMH5的末端，因此QepA蛋白属于具有外排泵活性的MFS蛋白[8]。在氟喹诺酮药物存在的情况下，QepA蛋白可能有这种类似的反应过程，形成药物-QepA蛋白-质子三元复合物，并将药物排出体外，从而使细菌对氟喹诺酮药物的敏感性降低[8,13]。但QepA蛋白三元复合物结合的顺序以及氟喹诺酮药物与质子交换的化学计量单位尚不明确，还未对其耐药机制和耐药过程进行更加深入的研究。

图1 MFS外排泵蛋白反应过程示意图

2 qepA基因的类型与分子特征

2007年法国和日本两个独立的实验室首次研究报道了qepA基因，法国报道的qepA基因来源于分离自比利时住院病人的大肠杆菌1540，携带qepA基因的质粒为pIP1206[7]；日本报道的qepA基因来源于分离自日本兵库县住院病人的大肠杆菌C316，携带qepA基因的质粒为pHPA[8]。两个质粒中的qepA基因完全相同，均为1 536 bp的核苷酸序列，包括511个氨基酸残基，等电点为9.73。其次该qepA基因具有很高的GC含量，为72 %，它可能来源于同样具有高GC含量的放线菌[8]。QepA蛋白能够降低细菌对亲水性氟喹诺酮类药物，主要是诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的敏感性，使其MIC增加8倍～64倍；但不能增加其对中度亲水性氟喹诺酮类药物，如培氟沙星、加替沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和疏水性氟喹诺酮类药物如萘啶酸的MIC[7-8]。在外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)存在的条件下，大肠杆菌1540和C316对亲水性氟喹诺酮药物的敏感性增高[7-8]。该基因随后被命名为qepA1，在尼日利亚[15]、墨西哥[16]、阿根廷[17]、玻利维亚[18]、中国[19]和阿尔及利亚[20]等国均有相关的研究报道。

2007年法国某实验室首次研究报道了qepA2基因，该基因位于大肠杆菌BicA的质粒pQep中，该菌分离自患肾盂肾炎的79岁女性病人的尿液和血液中[21]。qepA2基因与qepA1基因有两个核苷酸的差异，分别为C296 G、G400A；导致A99G、V134I。其编码的QepA2蛋白对亲水性氟喹诺酮药物诺氟沙星和环丙沙星的MIC增加4倍～16倍，但对恩诺沙星的敏感性无明显降低[21]。后来在大肠杆菌EC3319的质粒pEC3319中也发现了qepA2基因，该菌株分离自受伤的养殖场员工[19]。

2015年中国某实验室首次研究报道了qepA3基因，且5株肠杆菌科细菌的质粒均存在该基因[22]。其分别来自ICU住院病人血液中分离的大肠杆菌EC3157的质粒pEC3157和口痰分离的大肠杆菌EC3587的质粒pEC3587，感染科住院病人口痰分离的柯氏柠檬酸杆菌CD4359的质粒pCD4359，ICU住院病人血液分离的肺炎克雷伯氏菌KP3764的质粒pKP3764，手术病人胸腔感染的病原阴沟肠杆菌ECL3786的质粒pECL3786。qepA3基因与qepA1基因有5个核苷酸的差异，分别为C704A、C821T、G954C、T1115A、G1333A；导致A235G、P274L、T318C、M372L、A445T。其编码的QepA3蛋白对诺氟沙星的MIC增加8倍～16倍，对环丙沙星的MIC增加32倍～80倍，对非亲水性氟喹诺酮类药物氧氟沙星和左氧氟沙星的MIC分别增加16倍～160倍和80倍[19,22]。2017年Wang等又报道产气肠杆菌EA3201菌株中也存在qepA3基因[19]。

2017年葡萄牙和孟加拉两个独立的实验室首次研究报道了qepA4基因，葡萄牙报道的qepA4基因来源于大肠杆菌INSRA6015(血清型为O86:H28)[23]；孟加拉报道的qepA4基因来源于8株大肠杆菌与3株肺炎克雷伯氏菌，这11株菌均分离自水环境[24]。qepA4基因与qepA1基因存在两个核苷酸的差异，分别为C285A、G400A；导致P95L、V134I。QepA4蛋白与其它qepA等位基因编码的蛋白不同，其对亲水性氟喹诺酮药物诺氟沙星和环丙沙星的敏感性降低较少，MIC仅增加2倍～3倍，但其对萘啶酸的MIC增加可达6倍[23]。

分析4个qepA等位基因的进化关系，qepA2基因与qepA4基因只有一个核苷酸的差异，二者同源性最高；其次为qepA1基因，与qepA2基因和qepA4基因均有两个核苷酸/氨基酸的差异；qepA3基因与qepA1基因、qepA2基因和qepA4基因的亲缘关系最远，分别有5个、7个和7个核苷酸/氨基酸的差异[24](表1)。

表1 qepA等位基因的氨基酸序列差异及来源Table 1 Comparison of animo acid substitutions,and epidemiology of qepA alelle-producing strains

携带不同qepA等位基因的质粒有其各自特点。qepA1基因常和氨基糖苷类耐药基因rmtB共存，其两端均有一个含tnpA基因的IS26元件[8]；qepA2基因两端常各有一个ISCR3C元件，但没有IS26元件[21]；qepA3基因两端也有IS26元件，且其大多数质粒同时携带rmtB基因[22]；qepA4基因上游存在ISCR3元件和tnpA基因，但其周围并不存在rmtB基因[23]。qepA基因与rmtB基因的共存现象已有多篇文献报道，如动物源性大肠杆菌中58.3 %的rmtB阳性菌株携带qepA基因[10]；Deng等研究表明32.1 %的rmtB阳性菌株同时携带qepA基因，而rmtB阴性菌株则检测不到qepA基因，且rmtB-qepA阳性菌株其质粒多为F2:A-:B-型[9]。qepA基因与rmtB基因共存提示qepA阳性菌株多为多重耐药菌，其中氨基糖苷类药物在某些国家或地理区域被用作生长促进剂，故其共同存在可以促进细菌在人和动物环境中的生存。加强对动物中含qepA基因的革兰氏阴性病原菌的主动监测，或许会发现这种多重耐药菌的更大流行性。外排泵基因qepA在所报道的动物和土壤中出现的频率较高，可能促进亲水性喹诺酮类药物的完全耐药，增加耐药突变的几率，但仍需进一步研究来论证。

PMQR基因oqxAB和aac(6')-Ib-cr常与β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M存在于同一质粒，也有关于qepA基因与blaCTX-M基因存在于同一质粒的报道，但目前并不清楚qepA基因与β-内酰胺类耐药基因之间是否存在某种相关性[1]。

3 qepA基因在世界的流行情况

虽然qepA基因仅发现10余年，且整体流行率低于其它PMQR基因，但是据已有文献报道，已在除中亚以外的全球其它地区分离的细菌中均检测到qepA基因，且存在于多种动物来源的多种细菌中。

从流行的基因型看，qepA1基因在东亚(中国、日本和韩国)、南亚与东南亚(巴基斯坦、印度和越南)、西亚(伊朗)、欧美(法国、西班牙、葡萄牙、瑞士、罗马尼亚、土耳其、澳大利亚、加拿大、墨西哥、阿根廷和玻利维亚)与非洲(埃及、阿尔及利亚、尼日利亚和突尼斯)等国均检测到，且主要存在于大肠杆菌中，在肺炎克雷伯氏菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌等细菌中也有相关报道；关于qepA2基因的研究较少，仅在法国和中国有零星的相关报道，且仅存在于大肠杆菌中[19,21]；qepA3基因目前仅在我国发现；qepA4基因仅在葡萄牙和孟加拉国有相关报道，且存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中[23-24]。

从流行的国家来看，在东亚已在中国、日本和韩国检测到qepA基因。日本和韩国对其流行情况的研究主要集中于病人。在日本病人分离的大肠杆菌中qepA1基因的检出率较低，不超过3 %，在肺炎克雷伯氏菌中则未检测到[25]。在韩国病人分离的携带qepA1基因的病原菌大部分也是大肠杆菌，且qepA基因的检出率与日本报道的检出率相当，不超过5 %，也有从病人分离的产气肠杆菌中存在qepA1基因的相关报道，检出率为1.4 %，但在阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、粘质沙雷菌和肺炎克雷伯氏菌中不存在该基因[26]；分离自韩国的鸡和野生鸟类的大肠杆菌中也检测到qepA1基因，但检出率仅0.04 %[27]。南亚和东南亚关于qepA1基因流行的报道来自巴基斯坦、印度、孟加拉国和越南。在巴基斯坦分离自病人的肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌中检测到qepA基因，检出率不超过5 %[28]；在印度急性胃肠炎病人分离的恶臭假单胞菌中检测到qepA1基因，且发现医院污水中大肠杆菌qepA1基因的携带率近10 %[29]；在越南，分离自医院污水的大肠杆菌中，qepA1基因的携带率高达77 %[30]；在孟加拉国，分离自水环境的大肠杆菌中携带qepA4基因[24]。西亚关于qepA1基因的研究来自于伊朗，主要发现于人源大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中，携带率为2 %～6.2 %[31]。

欧美国家最早于2007年在法国报道发现qepA基因，即后来命名的qepA1，一年后又在121株肠杆菌科细菌中检测到一株大肠杆菌携带qepA2基因[21]，2017年在葡萄牙又有一株致病性大肠杆菌O86:H28携带qepA4基因的报道[23]。此外，分离自西班牙病人的沙门氏菌中也携带qepA1基因[32]，在葡萄牙的污水中分离的两株大肠杆菌[33]和在瑞士的河水中分离的一株大肠杆菌[34]也携带qepA1基因，这两项研究中qepA1基因的携带率并不高，分别为2.5 %和1.7 %。但来自罗马尼亚的研究显示，在人源和动物源沙门氏菌中qepA1基因的检出率高达20 %，这些菌株分离自鸡肉、猪肉和犬[35]。在土耳其的病人体内分离的大肠杆菌也存在qepA1基因的流行，但流行率并不高，不超过2 %，也未在肺炎克雷伯氏菌中检出该基因[36]。澳大利亚的的一项研究表明，分离自犬的大肠杆菌中qepA1基因携带率极高，达到73.2 %，且这些菌株均为氟喹诺酮类药物的耐药菌株[37]。在加拿大分离自病人的18株大肠杆菌中也发现其中一株携带qepA1基因，这是在北美地区首次发现菌株携带该基因[38]。在美国的伴侣动物中分离的大肠杆菌中qepA1基因的携带率相对较低，仅9.3%[39]。在拉丁美洲，最早于墨西哥发现qepA1基因的流行，携带该基因的大肠杆菌均来自于病人[16]；其后，在阿根廷[17]和玻利维亚[18]住院病人分离的大肠杆菌中也发现了qepA1基因的流行，但未在肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和摩氏摩根菌中检测到该基因[18]。

非洲最早于埃及发现qepA1基因，其在人源大肠杆菌的流行率较低，不到1 %；但在产AmpC大肠杆菌中qepA1基因的携带率可达41 %[40]。在阿尔及利亚分离的人源大肠杆菌中qepA1基因的流行率也较低，不超过4%[20]。而来自尼日利亚的研究则显示，在不同地区qepA1基因的流行率存在很大差别，为3.7 %～18.7 %[41]；对从动物肠道分离的大肠杆菌的研究显示，在分离自鸡的大肠杆菌中能够检测到qepA1基因，而在分离自猪的菌株中则未能检测到该基因[15]。突尼斯的一个研究小组研究显示，携带qepA1基因的大肠杆菌可随食物链进入动物源性食品[42]。在非洲的野生动物自然保护区，由于人类的活动含有qepA1基因的肠杆菌已进入大猩猩体内[43]。

4 qepA基因在我国的流行情况

由于氟喹诺酮类药物的滥用和不规范使用，造成我国广泛存在氟喹诺酮耐药菌株，在这些菌株中qepA基因的检出率也较高，并且存在3种等位基因：qepA1、qepA2和qepA3，造成我国qepA基因的总体流行情况高于发达国家和大部分发展中国家[2,22,44-47]。

在病人体内分离的菌株中，携带qepA1基因的包括大肠杆菌[48-49]、肺炎克雷伯氏菌[48]和志贺氏菌[46,50-51]；携带qepA2基因的仅在大肠杆菌中有相关报道[19]；携带qepA3基因的包括大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和柯氏柠檬酸杆菌[19,22,44]。从流行地区来看，已在北京[48]、浙江[19,22]、山东[49]、河南[50]、安徽[51]、江苏[46]和福建[44]等省(直辖市)检测到qepA1基因，其流行率为0.6 %～41.3 %；qepA2基因与qepA3基因仅在浙江地区有相关报道[19,22]。在医院废水中分离的革兰氏阴性菌中qepA1基因的流行情况较为严重，携带率可达16.1 %。因此，加强医院污水的处理对医院防控携带qepA基因的病原菌具有重要意义[52]。

动物源性菌株中qepA1基因的流行情况在我国报道较多。从流行的菌株类型看，大肠杆菌[1,47,53]、沙门氏菌[45]、克雷伯氏菌[53-54]、弗氏志贺氏菌[55]和阴沟肠杆菌[53]等中均有携带qepA1基因的报道。从菌株来源看，既有经济动物，如猪[1,11,53]、鸡[54]、鸭[53]、鹅[9]、山鹑[1,53]和牛[55]；也有宠物[9]，如犬[47,53]；也有其它动物和鸟类，还包括与动物密切接触的人(主要是饲养员)[9]；从养殖场环境和土壤中分离的细菌中也检测到qepA3基因[19]。从流行地区来看，在东北、华北、华东、华南、中南、西南和西北分离的动物源性细菌中均检测到qepA基因，表明该基因在我国的广泛流行，且qepA1基因的流行率往往高于10 %，尤其是在rmtB阳性菌株中。

qepA基因在我国已广泛存在于为人类提供动物性食品的经济动物中，也存在于长期与人相伴的宠物中，以及与养殖场密切相关的周围环境。因此，qepA基因通过细菌传递给人类的机会已无处不在。

5 小结与展望

在qepA基因发现的10余年时间里，科学家认识到其在人源细菌、动物源细菌的流行已成为全球性的公共卫生问题。虽然整体流行率低于其它PMQR基因，但其在世界各地及不同菌株、不同动物中广泛流行，且与其它质粒介导的氟喹诺酮耐药基因、氨基糖苷类耐药基因rmtB和/或β-内酰胺类耐药基因共存，显著增加了这些菌株的多重耐药几率。最近几年其等位基因qepA3和qepA4的相继出现表明耐药细菌已发生新的变化，虽然对于它们的相关报道较少，但可能已在其它国家和其它菌株中出现，需引起人们的重视。此外关于qepA基因的耐药机制和耐药过程还有很多不清楚的地方，例如QepA蛋白三元复合物结合的顺序以及氟喹诺酮药物与质子交换的化学计量单位，对此类问题的研究还较少。qepA3基因所在菌株首先分离自曾被养殖场工具划伤的病人，同时在养殖场环境和土壤中分离的菌株也携带该基因[19]，质粒介导的氟喹诺酮外排泵基因qepA能够在菌株间水平传播，但还没有相关证据表明其是否能够从动物和环境传播到人类，这有待进一步研究。最近有研究表明qepA基因的流行甚至存在季节性，其在夏季和冬季的流行高于春季和秋季，且在水环境中与某些金属离子呈正相关性[56]，如随着水中汞含量的升高，qepA阳性菌株也相应增加，这增大了富含金属离子污水中的细菌携带qepA基因的概率。

合理的使用抗生素是解决耐药问题的首要选择，农业部最新规定自2016年12月31日起在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和诺氟沙星4种兽药，相信能够逐渐减轻氟喹诺酮耐药问题。在今后的工作中，一是要加强对qepA基因基础研究的力度，以便更加深入的了解其耐药机制和耐药过程，以期为其流行防控提供理论支撑；二是要加强qepA基因在不同地区、不同动物和不同菌株流行情况的调查，掌握其流行态势和趋势；三是规范和减少氟喹诺酮类药物的使用，尤其是在动物饲料中的添加，以便在根本上降低qepA基因的流行。