牛副结核分枝杆菌的分离及鉴定

刘虹秀，程玉笛，党光辉，李田田，李 鹤，崔子寅，宋宁宁，陈利苹，刘思国

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队，黑龙江 哈尔滨150069)

副结核病(Paratuberculosis)又称为副结核性肠炎，是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis，MAP)引起的反刍动物的慢性消化道疾病，该病以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱襞为特征。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为B类疫病。根据菌株的培养特性及致病力将MAP分为牛型、羊型和生物中间型3个亚型[1]。副结核病在世界范围内广泛流行，近年来我国发病率也呈上升趋势[2]，给乳制品和牛养殖业造成了严重的经济损失，因此受到各国的高度重视，并投入大量人力、财力研究其防治措施[3]。

MAP的分离鉴定对了解我国奶牛副结核病的流行特点及病原学研究均具有重要意义，本研究采集新疆某奶牛场产奶量下降、腹泻消瘦疑似副结核病患牛的直肠刮取物，对其进行分枝杆菌的分离培养及抗酸染色，应用分枝杆菌种及型特异性PCR方法和序列分析，对分离株进行种和亚型的鉴定，确定了3株分离菌为牛型副结核分枝杆菌，为进一步研究副结核病的流行病学和病原学奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料MAP k10标准株由本实验室保存；鸟分枝杆菌CVCC277购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；新疆某牛场疑似副结核病牛的直肠刮取物样品37份；氯代十六烷基吡啶(HPC)、萘啶酮酸钠盐(naladixic acid)、万古霉素、两性霉素B购自美国Sigma公司；脑心浸液培养基(BHI)、卵黄琼脂培养基、7H9液体培养基购自美国BD公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Premix ExTaqDNA Polymerase购自TaKaRa公司。

1.2 引物设计 多重PCR引物(IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA gene)[4]、MAP分型鉴定引物(DMC529、DMC531、DMC533)[5]，均由哈尔滨博仕生物技术公司合成(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 直肠刮取物样品处理 采用改良的NADC[6]法，称取直肠刮取物样品1 g～2 g加入35 mL灭菌双蒸水中震荡，室温静置30 min后吸取全部上清经1 700 r/min离心20 min后弃掉上清，沉淀用含0.95%氯代十六烷基吡啶(HPC)的BHI培养基，即HPC-BHI溶液30 mL重悬，37℃孵育过夜。1 700 r/min离心20 min后弃上清，沉淀用1 mL混合抗生素液(100μg/mL naladixic acid；100μg/mL万 古 霉素；50μg/mL两性霉素B)重悬，37℃放置过夜，取0.2 mL悬液接种卵黄琼脂培养管(含50μg/mL naladixic acid；50μg/mL万古霉素)。

1.4 细菌的分离培养及与抗酸染色镜检 培养时先将接种后的卵黄琼脂培养基倾斜放置于37℃温箱培养1～2周，然后将培养基竖直放置，继续培养，每周查看培养基生长情况和污染状况，直至第12周。观察菌落形态，进行抗酸染色并在显微镜下观察染色结果。

1.5 3株分离菌的多重PCR鉴定 挑取单菌落接种于7H9液体培养基中，37℃摇床100 r/min培养8周，之后采用试剂盒提取细菌基因组DNA。以IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA gene 5对引物对分离菌进行多重PCR鉴定，反应程序：95℃8 min；95℃60 s、60℃40 s、72℃35 s，29个循环；72℃10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。多重PCR的5个产物在琼脂糖凝胶上很容易区分，其中16S rRNA基因对所有分枝杆菌具有特异性，可以扩增出484 bp的产物，MAP的IS900基因具有特异性，PCR可扩增出398 bp的产物，IS901是鸟分枝杆菌特异性基因，可扩增出753 bp的产物，296 bp的产物来自鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的特异性基因DT1，所有鸟分枝杆菌亚种均可扩增出IS1311基因的608 bp的产物。

1.6 MAP亚 型 鉴 定 以DMC529、DMC531、DMC533为引物进行MAP亚型鉴定，反应程序：95℃3 min；95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，25个循环；72℃7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测定并对PCR结果比对分析。

2 结果与讨论

2.1 细菌的分离培养与抗酸染色镜检 经处理的37份直肠刮取物样品经过5～14周培养后，其中7份样品在含分枝杆菌素的卵黄琼脂培养基上长出菌落，初始菌落很小(直径1 mm)，无色半透明半球状，边缘整齐，表面光滑，有光泽，随着培养时间延长，菌落变大(4 mm～5 mm)不透明，菌落的形态从光滑变粗糙，从半球状变为乳头状。挑取单菌落进行抗酸染色，在显微镜下可观察到红色略弯曲的细长杆菌，呈单个或分支状排列，符合分枝杆菌的形态学特征及抗酸染色特性(图1)，表明所分离培养的7株分离菌均为抗酸染色阳性菌。

图1 副结核分枝杆菌分离株抗酸染色结果Fig.1 Acid-fast staining of the M.paratuberculosis isolates

2.2 分枝杆菌种的多重PCR鉴定 提取7株分离菌的基因组为模板进行多重PCR扩增，结果显示，利用多重PCR方法鉴定的7株分枝杆菌中有3株分离菌扩增得到约400 bp、500 bp、600 bp 3条特异性条带，分别对应IS900、16S rRNA、IS1311 3个基因，与MAP阳性对照k10标准株一致，表明该3株分离株为MAP(图2)，分别命名为MAP-XJB01、MAP-XJB13、MAP-XJB37。

图2 副结核分枝杆菌分离株多重PCR检测结果Fig.2 Detection of the M.paratuberculosis isolates by multiplex PCR

2.3 MAP的亚型鉴定 用亚型特异性DMC529、DMC531、DMC533引物对已鉴定为MAP的3株分离菌进行PCR扩增分型。结果显示，3株MAP的DNA均扩增得到约300 bp的预期产物(图3)，将PCR产物进行测序分析，参照Collins[5]发表的鉴定MAP牛型和羊型的方法，通过Blast进行序列比对，测序所得的序列与报道的牛型MAP的序列同源性为100 %，确定本研究分离培养的3株MAPXJB01、MAP-XJB13、MAP-XJB37均为牛副结核分枝杆菌。MAP的不同亚型在流行上存在差异，已经在牛和其它物种中发现牛型流行株，而目前羊型流行株仅在绵羊中有报道[7]。造成这种结果可能是由于不同亚型MAP具有一定程度的宿主特异性、偏好性或适应性，在不同条件下有不同的感染方式或环境存活能力，这些条件倾向于感染一种或其它寄主物种。在实际生产中可以通过加强管理减少不同物种在易感时间内的接触来降低MAP不同亚型在不同物种之间感染传播的机会。

MAP属于胞内寄生菌，具有较强的环境和宿主适应性。对于病原学检测，由于对样品处理要求高、分离方法复杂、培养周期长，MAP的分离培养一直是个难题，本研究从患牛直肠刮取物中分离到MAP，证明本研究所用的分离培养方法可行，可以为MAP的分离培养提供参考。虽然目前检测副结核病有粪便培养、抗酸染色、抗体ELISA检测等多种方法，但由于缺乏准确的检测及检测标准，造成很多国家的动物副结核病患病率较难估计。本研究选用的多重PCR检测方法可以对分枝杆菌进行快速、特异、灵敏的检测和鉴定，为进一步开展MAP病原学和流行病学研究提供了必要的研究资料。

图3 副结核分枝杆菌分离株亚型鉴定结果Fig.3 Subtype identification of the M.paratuberculosis isolates