可诱导表达小反刍兽疫病毒P蛋白细胞系的建立

2018-03-04崔贝贝仇松寅张永宁吴晓东吴绍强韩雪清林祥梅

中国预防兽医学报 2018年12期

李霆，李茜，王娜，崔贝贝，仇松寅，张永宁，吴晓东，吴绍强，韩雪清，林祥梅*

(1.中国检验检疫科学研究院，北京100176；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032)

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告传染病，由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(PPRV)感染小反刍动物引起的一种以突然发热、眼鼻排出分泌物、口腔溃疡、肺炎和腹泻等为特征的传染病，山羊高度易感[1]。该病于1942年首次在非洲发生，随后在非洲大陆广泛传播，现已波及中东、西亚、南亚等地区[2-3]。该病于2007年传入我国西藏地区[4]，2013年又在新疆暴发，由于山羊和绵羊的大范围流动，该病已在我国境内迅速传播，截止2014年9月，全国共有22个省或自治区的256个县暴发疫情[5]，严重威胁了我国的畜牧业生产。

PPRV为单股负链RNA病毒，基因组大小为15948个核苷酸，基因组3'末端为前导序列，5'末端为尾随序列，6个编码框基因排列顺序为3'-N-P-M-F-H-L-5'，依次编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)。另外，P基因还编码2个非结构蛋白C和V[6-7]。P基因总长度为1 655个核苷酸，开放阅读框长度为1530个核苷酸，编码509个氨基酸，P蛋白理论分子质量约为54.8 ku，但由于P蛋白表达后大量的磷酸化修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示实际分子量为75 ku[8]。P蛋白是一种多功能蛋白，已有研究表明P蛋白可以在病毒RNA的转录和复制过程中发挥作用：P蛋白能与不同形式的N蛋白结合或单独与N蛋白-RNA模板复合物结合激活转录；P蛋白与L蛋白相结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶，然后与N蛋白-RNA模板结合形成核糖核蛋白复合体，进行病毒RNA的转录和复制[9-10]。此外，对麻疹病毒研究显示P蛋白能够阻断JANUS激酶1(Janus kinase 1，JAK1)对信号的传导及转录激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)的磷酸化而阻断干扰素反应[11-14]，这提示PPRV P蛋白可能具有相似的拮抗干扰素活性。为研究PPRV P蛋白的生化功能，本研究利用Tet on系统建立了可诱导表达PRRV P蛋白的细胞系，为PPRV的致病机理的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞及主要试剂含flag标签的pcDNA4/TO由本实验室改造并保存，T-REx293细胞由本实验室保存；KOD plus酶购自TOYOBO公司；限制性内切酶和T4连接酶购自NEB公司；病毒RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；逆转录试剂盒购自Promega公司；TOP10感受态细胞、质粒提取试剂盒和核酸凝胶回收试剂盒购自康为世纪公司；强力霉素、稻瘟菌素、flag单克隆抗体(MAb)、β-actin MAb、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(IgG-HRP)购自Sigma公司；磷酸化p-STAT1 MAb和STAT1 MAb均购自CST公司；AlexaFluor 594标记的山羊抗兔荧光二抗、博来霉素、胎牛血清和DMEM培养基均购自Thermo公司；转染试剂jet-PRME购自Polyplus公司；ECL发光液购自GE公司；聚肌胞苷酸(Polvriboinsine-polyribocyaidylic acid，polyI:C)购自Invivogen公司；PPRV购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司；PPRV山羊阳性血清由中国动物卫生与流行病学中心吴晓东研究员惠赠。

1.2 pcDNA4/TO-PPRVP重组质粒的构建根据NCBI数据库的PPRV Nigeria75/1株(X74443.2)的P基因序列设计引物PRR-P-F：5'-GATCGGCCGGCCG ATGGCAGAAGAACAAGCATAC-3'/PRR-P-R：5'-GA TCGGCGCGCCTTACGGCTGCTTGGCA-3'。根据病毒RNA提取试剂盒说明书，提取PPRV总RNA，反转录为cDNA。以该cDNA为模板，经PCR扩增获得PPRV全长p基因。PCR扩增产物经FseⅠ/AscⅠ双酶切后克隆至pcDNA4/TO载体中，构建重组质粒pcDNA4/TO-PPRVP，并经过酶切和测序鉴定。

1.3 可诱导表达P蛋白细胞系的筛选及建立参照jetPRME转染试剂说明书，将pcDNA4/TO-PPRVP转染至已稳定转入pcDNA6/TR质粒的T-REx293细胞。按照有限稀释法将转染后的细胞接种至96孔细胞培养板，2 d～3 d后用300μg/mL的博来霉素和10μg/mL的稻瘟菌素加压筛选，待细胞长满后依次扩增至24孔细胞培养板和6孔细胞培养板。传代并分出部分细胞至新6孔板内，添加或者不添加1μg/mL强力霉素诱导P蛋白表达，24 h后收集细胞，以鼠抗flag MAb(1∶5 000)为一抗，以山羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)为二抗，采用western blot检测诱导后P蛋白的表达。将western blot筛选获得的强阳性克隆，经间接免疫荧光(IFA)进一步验证诱导P蛋白的表达情况，即以鼠抗flag MAb(1∶500)为一抗，以羊抗鼠IgG-AlexFlur594(1∶500)为二抗，在蔡司LSM880激光共聚焦显微镜下观察荧光染色结果。扩增和保存表达量高的细胞株，命名为T-REx293-PPRV-P。

1.4 T-REx293-PPRV-P细胞系表达稳定性的检测将T-REx293-PPRVP在博来霉素筛选压力下常规传代，将第二代细胞系添加1μg/mL强力霉素诱导24 h、48 h和72 h后，通过western blot检测诱导不同时间后P蛋白的表达稳定性；为了检测不同代次细胞系的P蛋白表达稳定性，在传至第2代、第8代、第16代时分别添加1μg/mL的强力霉素，诱导表达24 h后进行western blot检测重组P蛋白的表达。

1.5 重组P蛋白的活性检测在铺满T-REx293-PPRV-P细胞系6孔细胞板内分别添加1μg/mL强力霉素诱导P蛋白表达，24 h后裂解细胞总蛋白并定量，用山羊抗PPRV阳性血清为一抗，以兔抗山羊IgG-HRP(1∶2 000)为二抗，western blot检测P蛋白的反应原性。在铺有T-REx293-PPRV-P细胞系的6孔细胞板内分别添加或者不添加1μg/mL强力霉素诱导P蛋白24 h后，再转染polyI∶C诱导STAT1磷酸化，转染12 h后经western blot检测P蛋白的表达以及P蛋白的表达对STAT1磷酸化修饰水平的影响。

2 结果与讨论

2.1 Tet on细胞系的筛选和鉴定以PPRV cDNA为模板，PCR扩增出长度约1.5 kb片段(图1A)，双酶切后克隆至pcDNA4/TO载体中。重组质粒经FseⅠ/AscⅠ双酶切鉴定后显示插入片段约1.5 kb，与预期相符合(图1A)。测序表明插入片段基因序列正确，片段大小为1 530 bp，表明重组质粒pcDNA4/TO-PPRVP构建正确。将此pcDNA4/TO-PPRVP转染至T-REx293细胞中，经博来霉素和稻瘟菌素加压培养，挑选单细胞克隆株，并对挑选的约20个单细胞克隆株通过western blot检测重组P蛋白的flag标签，结果有多株细胞克隆在诱导之后表达了分子量约75 ku的特异蛋白，而未诱导细胞则未表达此蛋白(图1B)。挑取其中表达量最高的细胞克隆经IFA检测，结果显示，诱导后的细胞株均呈现出均匀的红色荧光，且P蛋白主要分布在细胞浆内，而未诱导细胞内则无荧光(图1C)。上述western blot和IFA结果表明经筛选获得了可诱导表达PPRVP蛋白细胞系，命名为T-REx293-PPRV-P。

图1 表达PPRV P蛋白细胞系的筛选和鉴定Fig.1 Screening and identification of T-REx293-PPRV-phosphoprotein cell line

2.2 T-REx293-PPRV-P细胞系表达P蛋白的稳定性检测将第二代细胞系添加1μg/mL强力霉素诱导后不同时间经western blot检测结果显示P蛋白在诱导24 h、48 h和72 h持续表达，且表达量随时间延长而递增(图2A)。表明该细胞系表达的P蛋白在强力霉素诱导后72 h以内均能够稳定表达，且未出现明显降解。对不同代次细胞诱导表达稳定性检测结果表明第2代、第8代、第16代细胞系均能够经诱导后产生目的条带(图2B)。表明，建立的细胞系能够稳定表达PPRV P蛋白。

2.3 重组P蛋白的活性检测将强力霉素诱导和未诱导的细胞系裂解物进行western blot检测。结果显示，强力霉素诱导后的细胞裂解产物均能够与PPRV阳性血清反应，产生75 ku的目的条带，与flag标签抗体鉴定结果相同，而与阴性血清不发生反应(图3A)。表明重组P蛋白具有较好的反应原性。细胞系经强力霉素诱导P蛋白表达，然后采用干扰素诱导剂polyI:C诱导细胞STAT1磷酸化，通过western blot检测P蛋白对STAT1的磷酸化的影响。结果显示诱导表达的P蛋白可以有效抑制poly-I:C诱导的STAT1的磷酸化(图3B)。表明，重组P蛋白具有拮抗干扰素产生的活性。

综上所述，本研究建立了可诱导表达PPRV P蛋白的T-REx293-PPRV-P细胞系，该Tet on细胞系表达的重组P蛋白不仅具有与天然PPRV P蛋白类似的活性，还可以应用于PPRV P蛋白对干扰素等免疫信号通路的调控分析，进而为PPRV P蛋白后续的功能研究奠定了良好基础。