川楝子黄酮的提取和初步纯化

谢肖锋

（贵州大学 药学院，贵州贵阳 550025）

川楝子（Fructus Toosendan）是落叶乔木川楝树（Melia toosendan Sib.et Zucc.）的干燥成熟果实，在冬季采收[1]。川楝子作为驱虫药已有悠久的历史，同时也作为传统的理气药，主产于川、黔、湘、鄂等地，其中川产为上乘，而作为道地药材，因此被称作川楝子[2]。《本草纲目》有记载，此药味道酸而苦，具有毒性，是寒性药；入肝、胃、小肠经。现代药理研究实验证明，川楝子具有驱蛔杀虫、抗菌、抗肉毒、消炎、镇痛、抗病毒、抗肿瘤[3]、抗氧化、抑制破骨细胞[4]等作用。川楝子中主要活性成分有川楝素等萜类化合物和黄酮类化合物[5]。

黄酮化合物的提取方法主要有超声提取法、微波提取法、超临界流体提取法、酶提取法、水浸出法和有机溶剂提取法等[6]。虽然超声提取、超临界提取和酶提取等方法提取效果好提取效率高，但考虑设备比较昂贵，提取条件要求高和经济投入大且难以进行大规模工业提取。因此，目前工业化普遍采用水提或有机溶剂提取法[7-8]。本文采用含水乙醇回流法设计单因素实验和正交实验进行川楝子黄酮的提取，采用树脂吸附法进行川楝子黄酮的初步纯化，为川楝子资源的进一步研究和利用提供参考依据。

1 实验材料

1.1 药材

川楝子，购于贵州省药材公司。

1.2 主要试剂

亚硝酸钠（AR，南台华鑫化学试剂有限公司）；硝酸铝（AR，广东汕头市西陇化工厂）；氢氧化钠（AR，重庆川江化学试剂厂）；95%乙醇（AR，重庆川江化学试剂厂）；AB-8树脂（天津市光复精细化工研究所）；D101树脂（天津市光复精细化工研究所）；NKA-9树脂（天津市光复精细化工研究所）；聚酰胺树脂（30目-60目）（青岛海洋化工生物有限责任有限公司）；芦丁标准品（1198-081209购于国家工程研究中心，纯度≥98%）。

1.3 主要仪器

FA2004分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）；DS-205A超声波发生器（宁波市海曙达盛超声波仪器厂）；HH-S电热恒温水浴锅（江苏金坛市亿通电子有限公司）；UV-1801分光光度计（北京北分瑞利分析仪器有限责任公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；WFZ-2000分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；JA1203精密电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；KH-500DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 原材料预处理

将购买的川楝子药材放入烘箱60℃烘48 h，粉碎，过60目筛，备用。将新购买的D-101、聚酰胺树脂浸泡在95%的乙醇中24 h，使树脂充分溶胀，然后用95%乙醇冲洗，直到流出液加水不出现白色浑浊为止，再用蒸馏水冲洗至无醇味。用5%盐酸溶液冲洗浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性，再用5%NaOH溶液冲洗并浸泡4 h，最后用蒸馏水洗至中性，备用[9]。

2.2 对照品溶液的制备

称取芦丁对照品（60℃下干燥至恒重）21.80 mg置于100mL容量瓶中，加入一定量乙醇在超声下使其完全溶解，乙醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液。

2.3 芦丁标准曲线绘制

在400～600 nm的波长范围内测定对照品溶液的吸光值。测定结果显示在509 nm波长处有最大吸收，因此选择509 nm为检测波长。

吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL和7.0mL，分别置于7个25mL容量瓶中，均加入乙醇至8mL，加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀后静置6 min，加入1.0mL 10%硝酸铝溶液，摇匀后静置6 min，加10.0mL 4%氢氧化钠溶液，加蒸馏水至刻度，摇匀后静置15 min，以乙醇代替对照品溶液作为空白对照，在509 nm波长下测定吸光值，以吸光值为纵坐标，芦丁浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程和R2。

2.4 提取方法

称取一定量川楝子粉末置于圆底烧瓶中，加入一定量适宜浓度的乙醇，加热微沸回流提取一定时间，抽滤，减压浓缩，真空干燥备用。

分别对上述提取方法中的液料比、乙醇浓度、提取时间三个影响因素进行单因素考察和正交试验优化。

2.5 川楝子黄酮的含量测定

精密量取供试品溶液3.0mL置于25mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀后静置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀后静置6 min，加入10.0mL 4%氢氧化钠溶液，加蒸馏水至刻度，摇匀后静置15 min，以70%乙醇代替供试液作为空白对照，在509 nm波长下测定吸光值，并对照标准曲线，计算川楝子中黄酮的含量。

2.6 D101大孔树脂纯化工艺考察

2.6.1 动态上样量的考察

树脂的泄漏曲线与富集效率密切相关，根据上述静态吸附率和解吸率，选择较好的一种树脂。取一定量预处理树脂，柱床体积（BV）为30mL，湿法装入1.6 cm×30 cm层析柱，将川楝子粗提物水溶液（质量体积比为79.6 mg/mL）以2mL/min的流速动态吸附，以10mL每份收集流出液，测定吸光值，计算流出液总黄酮浓度，绘制树脂的泄漏曲线。

2.6.2 提取液不同pH对树脂动态吸附的影响

取5根1.6 cm×30 cm的层析柱，分别装入预处理好的D101树脂30mL，上样液90mL（质量体积比为79.6 mg/mL），pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，以2mL/min的流速进行上柱，根据上样液浓度和流出液浓度计算吸附率，确定最适样液的pH值。

2.6.3 上样流速对树脂吸附的影响

取4根1.6 cm×30 cm的层析柱，分别装入预处理好的D101吸附树脂30mL，上样液90mL（质量体积比为79.6 mg/mL），分别以1、2、3、4mL/min的流速进行上柱，根据上样液浓度和流出液浓度计算吸附率，选出最佳上样流速。

2.6.4 不同浓度乙醇洗脱对解吸率的影响

取5根1.6 cm×30 cm的层析柱，分别装入预处理好的D101吸附树脂30mL，上样量均为90mL（质量体积比为79.6 mg/mL），先以5BV蒸馏水洗脱，然后再分别用40%，50%，60%，70%和80%乙醇各50mL按2mL/min速度洗脱，洗脱液测黄酮含量，确定最佳醇洗浓度。

2.6.5 洗脱液流速对解吸率的影响

取4根1.6 cm×30 cm的层析柱，分别装入吸附饱和的D101树脂30mL，先用5 BV蒸馏水洗脱，然后用60%的乙醇5BV洗脱，分别控制流速为1、2、3、4mL/min收集洗脱液，计算洗脱率，选出最佳洗脱液流速。

2.6.6 洗脱剂用量考察

取1.6 cm×30 cm的层析柱，装入吸附饱和的D101树脂30mL，先以5BV蒸馏水洗脱，然后以60%乙醇，2mL/min的流速进行洗脱，每10mL收集1次洗脱液，测定吸光值，计算总黄酮浓度，确定洗脱体积和终点。

2.7 类似方法考察聚酰胺树脂纯化工艺

3 实验结果

3.1 芦丁标准曲线

按照2.3的方法，绘制得到芦丁标准曲线，结果如图1所示。从图1可知，在8.72～61.04 mg/L的浓度范围内，吸光度值与总黄酮浓度呈良好的线性关系，回归方程为y=0.015 1x-0.038 7，R2=0.998 5。

图1 芦丁的标准曲线

3.2 提取单因素考察结果

乙醇浓度对提取率的影响如图2，结果选择70%乙醇浓度。

图2 乙醇浓度的考察

液料比对提取率的影响如图3，结果选择30∶1的液料比。

图3 液料比的考察

提取时间对提取率的影响如图4，结果选择回流提取时间为3 h。

图4 提取时间的考察

3.3 正交实验结果

根据单因素试验结果，选用L9（34）正交表格，选择液料比（A）、乙醇浓度（B）、回流时间（C）为考察因素，选择适当的因素水平范围，以川楝子黄酮提取率为指标对川楝子总黄酮提取工艺进行正交试验，见表1。

正交试验设计和结果见表2和表3。由表2可以看出，各因素对川楝子黄酮提取的影响主次为：液料比＞乙醇浓度＞提取时间。液料比和乙醇浓度具有显著性影响。最佳提取条件为A2B2C3，即液料比35∶1，乙醇浓度70%，提取时间3.5 h。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

3.4 大孔树脂D101工艺参数

树脂动态饱和吸附量的测定如图5，选择60mL为合适的上样量。

图5 上样量的考察

上样液pH对吸附率的影响如图6，选择上样液pH值为6。

图6 上样液pH的考察

上样流速对树脂吸附的影响如图7，最佳上样流速选择2mL/min。

图7 上样流速的考察

不同浓度乙醇洗脱对解吸率的影响如图8，采用60%乙醇为洗脱剂。

表2 正交试验设计及直观分析表

表3 正交试验方差分析

图8 洗脱剂浓度的考察

洗脱液流速对解吸率的影响如图9，选择2mL/min为最佳洗脱流速。

图9 洗脱流速的考察

3.4.6洗脱终点的确定，如图10，确定90mL为洗脱剂用量。

图10 洗脱终点的考察

聚酰胺树脂工艺考察结果，上样质量体积比为78.8 mg/mL，上样流速为2mL/min，上样量为90mL（BV=30mL），吸附4 h后，用70%乙醇洗脱，洗脱流速为2mL/min。

4 结论

通过提取工艺单因素实验和正交实验，得到提取最佳工艺条件为：液料比35∶1，乙醇浓度70%，回流时间3.5 h，重复回流3次，在此工艺下，提取物黄酮含量为3.71%，得率为0.585%。

通过纯化工艺的初步考察实验，得到初步纯化工艺为：提取物黄酮含量可从原来的3.71%提高到20.3%。

5 讨论

通过对川楝子黄酮的提取实验得到的一些经验：药材回流提取完成后冷却到一定程度趁热过滤，否则会形成果冻状；减压蒸馏时候要注意避免溶液爆沸。这可能与药材中含有多糖皂苷等杂质有关。乙醇回流提取重复性好，污染小，成本低，容易实现工业化，同时采用紫外分光光度法测定黄酮含量简便快速。采用大孔树脂法进行初步纯化，对黄酮含量流失较少，工艺参数可控。本实验可为川楝子黄酮的进一步研究开发提供参考。

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2]孙建.川楝子化学成分及炮制质量评价研究[D].济南:山东中医药大学,2009.

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