炎琥宁对COPD大鼠肺组织IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路影响探讨

肖祖克 ，孙 慧 ，叶 东 ，李 星

(1、江西省人民医院呼吸科，南昌 330006；2、江西中医药大学附属医院，南昌 330006；3、江西省永修县人民医院，永修 330300)

越来越多的证据表明，IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路在CS引起的肺部炎症中起着重要的作用[1]。本次研究中，以炎琥宁对COPD大鼠肺组织IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路影响进行研究分析为目的，建立了COPD大鼠模型，并对正常对照组、COPD大鼠组、COPD炎琥宁注射液组大鼠血清以及肺泡灌洗液中的各项指标进行了检测，并对检测结果进行了统计分析，结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物雄性SD大鼠，体重在180-220g，级别为SPF。适应性喂养1周后开始实验。脂多糖购自Sigma公司，批号为L2880；椰树牌香烟，焦油量为11mg，氯化钠注射液，购自贵州科伦药业有限公司，批号为B160623I；变色硅胶，购自青岛裕睿化工有限公司，批号为160802；苦味酸为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂，批号为160403；水合氯醛购自天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20160305；瑞姬氏染色试剂盒，购自西化仪（北京）科技有限公司，型号为81/M322967；磷酸盐缓冲液，购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号为NXH0696；自制烟熏箱（亚克力材质）；电子天平购自深圳市华恒科技有限公司，分析天平购自香港佳立国际有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组方法 取大鼠（8周龄，雄性）60只，分为正常组、COPD造模组、COPD造模注射炎琥宁组，每组20只。分组后对各组大鼠进行标记并编号，分组标记后给予各组大鼠同样的饲料及饮用水。

1.2.2 给药方法 造模2个月后，开始给予各组分别进行药物治疗，共持续28d。正常对照组：10ml/kg注射用生理盐水，腹腔注射，每天1次；COPD组：10ml/kg注射用生理盐水，腹腔注射，每天1次；炎琥宁组：炎琥宁36mg/kg，腹腔注射，每天1次。

1.2.3 取材 肺泡灌洗液的采集：腹主动脉采血后，剪开大鼠的颈部皮肤，暴露颈部器官，打开胸腔，剥离覆盖肺组织的胸腺和心包，然后找到气管分支，结扎右主支气管，用0.9%的无菌生理盐水6ml，经气管注入左主支气管及左肺，反复慢慢回抽4次，回抽液大约 4-5ml，回收率 70%-80%，于 4℃，3000r/min 下离心10min，吸取上清液，置于2ml冷冻管中，-80℃超低温冰箱保存。肺泡灌洗液离心后所得的细胞沉淀用1ml灭菌的PBS重悬后，保存于2ml冷冻管中，4℃冰箱中保存，用于白细胞计数与分类计数。肺组织固定方法：结扎左肺，松开右肺，经气管注入4%的多聚甲酸溶液5ml，固定30s，取出右肺中叶，于4%的多聚甲酸中保存，用于HE染色。

1.2.4 检测方法 冰箱中取出大鼠血清、BALF上清液，放至室温，严格按照ELISA试剂盒操作说明书进行大鼠血清和 BALF 中 IFN-γ，IL-12，IL-12R，IL-4，IL-4R水平检测。

1.3 数据处理 采取SPSS 18.0统计学软件进行数据处理，计量资料经（x±s）形式表示，统计分析采取t检查，计数资料统计分析采取χ2检验，P＜0.05时，视为差异存在统计学意义。

2 结果

COPD大鼠组IL-4R、IL-4水平较正常对照组发生显著降低 （P＜0.05），IFN-γ、IL-12、IL-12R 水平较正常对照组发生明显升高（P＜0.05）；COPD炎琥宁注射液组大鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、IL-12R水平较COPD大鼠组发生明显降低（P＜0.05），IL-4、IL-4R 水平较 COPD 大鼠组发生明显升高（P＜0.05）。 见表 1。

表1 各组大鼠血清以及肺泡灌洗液中IFN-γ检测结果比较

3 讨论

STAT是一种新型的转录因子家族，主要负责连接胞外细胞因子与Th分化转录因子之间的胞内信号传递[2]。在Th0细胞分化为Th1细胞和Th2细胞的过程中，一种细胞因子在信号转导中对STAT分子的选择具有一定特异性，IL-4激活STAT6诱导Th2分化，IL-12激活STAT4诱导 Th1分化[3]。STAT4是决定Th1细胞因子作用的关键信号因子，其信号途径由IL-12激活，可以诱导Th1效应因子IFN-γ的转录和表达。STAT6信号途径依赖IL-4诱导，其在Th2细胞基因表达及发育上发挥重大作用。因此可见，通过IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路活化和诱导的Th1、Th2细胞分化，可直接影响COPD气道炎症及病理改变的发生发展[4]。

炎琥宁系穿心连提取物经酯化、脱水、成盐精制而成，具有抗炎、灭菌的作用。本实验我们假设，炎琥宁IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路对抗CS对COPD大鼠肺部的免疫失衡，从而对延缓肺泡上皮细胞的炎症反应和氧化应激，达到保护肺部的作用[5]。

本研究通过建立COPD大鼠模型，设置正常组、COPD大鼠组及炎琥宁注射液COPD大鼠组，检测各组大鼠血清、肺泡灌洗液中细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R 水平，并提取大鼠肺组织， 检测STAT4、STAT6蛋白水平，及STAT4mRNA、STAT6mRNA的表达情况[6]。实验研究显示， 各组大鼠在 IFN-γ、IL-12、IL-12R、IL-4、IL-4R、STAT4、STAT6蛋白水平存在差异，由此证实，炎琥宁可通过IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信号通路影响COPD疾病进展。

表2 各组大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-12、IL-12R检测结果比较

表2 各组大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-12、IL-12R检测结果比较

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表3 各组大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4、IL-4R检测结果比较（

表3 各组大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4、IL-4R检测结果比较（

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