体外热处理精子对精子关键基因表达的影响＊

巢时斌，吴成亮，张 杰，苏占荣，辜 敏

(江西省九江市妇幼保健院，九江 332000)

获得性免疫缺陷综合征（AIDS），它是被人类免疫缺陷病毒 （HIV）所感染引起的性传播疾病。HIV病毒是一种对热非常敏感的病毒，在56℃中30min就被完全灭活[1，2]。本项目组提出一种假说，以精子的热耐受性理论为基础，建立一种体外精子热处理程序。在完全灭活精子HIV的情况下，采用单精子卵胞浆内注射技术，联合卵子激活，重建精子的受精功能。达到完全阻断经精子垂直传播HIV的目的。因此切断精子垂直传播HIV研究更加迫切。本项目研究目的是可以提供一种医疗干预手段，从而可以彻底阻断通过精子垂直传播 HIV的途径。此外，这种手段的建立不仅可以应用在防止精子传播HIV上，也适用于防治其他不耐热病原体，如丙肝病毒和梅毒螺旋体等通过精子的垂直传播。

1 材料和方法

4℃，10000rpm/min离心10min，小心吸取上清，即可获得总蛋白。根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1-2h，后湿法转膜30-50min。一抗鼠单克隆抗体βactin（1/2000）、兔单克隆抗体 Nrf2（1/1000）溶液孵育，4℃过夜；二抗羊抗鼠 IgG（1/2000）溶液中室温孵育1-2h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。

1.3 统计学分析 所有数据均用SPSS 20.0统计分析，用表示，经t检验显著性差异，以P＜0.05作为显著性差异。

图1 各组热应激蛋白质HSP70的表达情况（*P＜0.05）

1.1 实验动物与分组 清洁级BALB/c小鼠。⑴37℃ 30min（阴性对照）；⑵42℃ 30min（一般细胞热处理）；⑶56℃ 30min（病毒灭活条件）；64℃ 30min（精子高温处理）；然后以上4个大组又分为以下3个小组：受热后恢复0min、受热后恢复1h、受热后恢复4h。

1.2 方法 取各组进行RNA的提取，提取RNA后根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，操作体系

RNase Free dH20 9.5μl

cDNA/DNA 1μl

上游引物 1μl

下游引物 1μl

2xULtraSYBR Mixture 12.5μl

反应程序，三步法：

步骤 温度 时间

预变性 95℃ 10min

变性 95℃ 10s

退火 56℃ 30s

延伸 72℃ 30s

循环 40

融解曲线分析

95℃ 15s

56℃ 1min

95℃ 15s

56℃ 15s

56℃ 15s

95℃ 0.5℃

计算相对表达量

△△Ct=△Ct试验-△Ct对照

相对表达量=2-△△Ct

算出各组组织中HSP70、HSP90和DDB1的相对表达量。引物序列如下：HSP70：

F：AGCAGACGCAGACCTTCAC R：TACACCTGGA TCAGCACCC HSP90：F：GACCCTTCTAAGTTGGA CAGCR：CAGACGACTCCCAGGCATADDB1：F：CTGCCACCACTGATGAGGA R：CCCACGCTTTTG ATGACC 内参 GAPDH F：CCTCGTCCCGTAGACA AAA R：TCGCTCCTGGAAGATGG

取各组加入裂解液，放冰上裂解30min后，

2 结果

2.1 热应激蛋白质HSP70的表达 如图1所示，热应激蛋白质HSP70随着受热温度的升高表达而升高，与阴性对照组相比，其他温度组差异具有统计学意义（P＜0.05）。在64℃受热后，随着恢复时间的延长表达也随之升高，与恢复0min相比，1h和4h的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。在恢复4h时表达最高。

2.2 热应激蛋白质HSP90的表达 如图2所示，热应激蛋白质HSP90随着受热温度的升高表达而升高，与阴性对照组相比，其他温度组差异具有统计学意义（P＜0.05）。在64℃受热后，随着恢复时间的延长表达也随之升高，与恢复0min相比，1h和4h的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。在恢复4h时表达最高。

2.3 基因修复功能基因DDB1的表达 如图3所示，基因修复功能基因DDB1在64℃受热后恢复4h表达最高，与阴性对照组相比，基因修复功能基因DDB11h随着受热的温度升高和恢复时间的延长而表达升高；并且与阴性对照组相比，64℃处理后再恢复4h组差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 各组热应激蛋白质HSP90的表达情况（*P＜0.05）

图3 各组热应激蛋白质DDB1的表达情况（*P＜0.05）

3 讨论

在世界范围内，艾滋病的防治形势依然严峻。2012年，全世界HIV感染已经达到3400万[3]。2011年联合国艾滋病防治曙提出 “Zero new HIV infections”的口号。这需要各个方面的一起努力，防止HIV病毒的传播。不论在世界范围内还是中国，HIV的传播都出现一些新的情况，一个重要的趋势是HIV在男同性恋之间的传播增加，直接导致男性艾滋病患者的增加。因此切断通过精子垂直传播HIV研究有更加迫切的需要。HSP70是分子量约70kD的热休克蛋白，是热休克蛋白家族中组重要的一员，被称为主要热休克蛋白。通常情况下分子量为70KD的热休克蛋白在正常细胞中表达水平会比较低，但是如果处在应激状态下该蛋白可以明显升高。在正常情况下HSP70是位于胞浆内，当受到热休克刺激时，核内HSP70迅速增加[4，5]。因此本研究利用不同温度处理精子后再用不同时间恢复，结果发现热应激信号通路开始运行，在半小时的热处理结束时，已经可以检测出HSP70表达上调，之后细胞回到正常培养条件，HSP70表达上调依然会持续一段时间。在真核生物体内DDB1的表达是高度保守的，如人的DDB1和小鼠的DDB1氨基酸序列一致性达到99.5%[6]。当细胞受到刺激后，细胞内DDB2受到诱导而累计，并且会将DDB1转运至细胞核[7]。在动物和人的细胞中，CUL4-DDB1复合体参与DNA的损伤修复，调节基因的转录，调控基因组的复制[8]。本研究结果发现，DDB1的表达在高温处理后表达会下降，随着正常处理后该基因的表达会升高。这结果说明受热处理后再恢复正常培养后能够运行自我修复功能。本结果对ROS（ROS，活性氧自由基，DNA损伤一大原因）检测结果，精子在热处理结束后检测到ROS含量上升，而ROS含量在精子刚回到正常培养条件后再过一段时间才会下降。这个实验在回复正常培养条件后设置了多个检测时间点，如果受较高温度热处理的精子 （如56℃组），HSP70表达量接近甚至高于受正常热处理的精子 （42℃组）或者在正常培养条件下HSP70表达量峰值接近甚至高于受正常热处理的精子（42℃组），而ROS积累量也最终降低。

综上所述，精子在高温处理后能够运行自我修复功能，在正常培养恢复一段时间后一般能够完成自我修复的精子恢复到了健康的状态。

[1]Charm SE，Landau S，Williams B，Horowitz B，Prince AM，Pascual D：High-temperature short-time heat inactivation of HIV and other viruses in human blood plasma[J].Vox Sang 1992，62(1)：12-20.

[2]付俊，龚正华，廖清华.江西省2013年男男性作为人群艾滋病感染率及相关高危作为现况分析[J].江西医药，2014，49(10)：969-972.

[3]Sholeye OO，Omotosho TJ，Kuponiyi OT，Abosede AO：Safeguarding the health of the Nigerian worker：the role of a workplace HIV/AIDS policy[J].Niger J Med，2012，21(2)：134-137.

[4]Multhoff G，Pockley AG，Schmid TE，et al.The role of heat shock protein 70(Hsp70)in radiation-induced immunomodulation[J].Cancer Letters，2015，368(2)：179-84.

[5]朱林波，付春瑜，李晔，等.肿瘤热休克蛋白70联合灵芝孢子粉对荷瘤小鼠的治疗作用[J].江西医药，2011，46(9)：795-798.

[6]Wu Y，Zhou X，Barnes CO，et al.The DDB1-DCAF1-Vpr-UNG2 crystal structure reveals how HIV-1 Vpr steers human UNG2 toward destruction[J].Nature Structural&Molecular Biology，2016，23(10)：933.

[7]Gao J，Buckley SM，Cimmino L，et al.The CUL4-DDB1 ubiquitin ligase complex controls adult and embryonic stem cell differentiation and homeostasis[J].Elife，2015，4.

[8]Chen YA，Peng YJ，Hu MC，et al.The Cullin 4A/B-DDB1-Cereblon E3 Ubiquitin Ligase Complex Mediates the Degradation of CLC-1 Chloride Channels[J].Scientific Reports，2015，5：10667.