基于网络药理学的“金银花-板蓝根”药对作用机制研究Δ

吴嘉瑞，蔺梦娟，刘鑫馗

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

“金银花-板蓝根”药对为清开灵注射液中的重要药物组合。金银花为甘寒之品，能清热解毒、疏散风热，善清肺、心、胃之热毒，有透热达表、透营转气之功；板蓝根苦寒，入心、胃经，善清热解毒、凉血利咽[1-2]。以往对中药的作用机制研究多采用动物实验、细胞实验等方法对其某一作用机制进行研究，难以获得中药作用机制网络的整体面貌。近年来，网络药理学融合系统生物学、多向药理学、生物信息学和计算机科学等多学科的技术和内容，进行“疾病表型-基因-靶点-药物”等多层次网络的构建，探索药物与疾病间的关联性，指导新药研发，阐明药物作用机理，其整体性、系统性及复杂性的研究视角和研究方法，与中医药的特点不谋而合[3]。因此，本研究基于网络药理学方法，通过构建“金银花-板蓝根”药对的“药物-成分-靶标-疾病”多层次生物网络，结合基因功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，开展清开灵注射液的作用机制研究。

1 资料与方法

1.1 药物分子信息的收集和活性分子的筛选

通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)数据库获得金银花和板蓝根的分子信息，包括分子名称、InChI Key、相对分子质量(molecular weight，WM)、辛醇-水分配系数(ALogP)、氢键配位电子供体数目(Hdon)、氢键配位电子受体数目(Hacc)、可旋转键数目(RBN)、分子极性表面积(TPSA)、类药性(drug-likeness，DL)、血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)、半衰期(half life，HL，t1/2)和分子结构。其中，考虑到含糖基的化合物在体内可能通过糖苷酶水解作用被去糖基，TCMSP数据库中也收录了这些化合物的糖苷配基，并将其命名为“化合物_qt”，因此，所获得两者的药物分子中可能也包括这些化合物的糖苷配基[4]。中药成分复杂，经过制剂工艺和体内过程，并非所有成分均能进入体内发挥药效；考虑中药注射剂的剂型特点，结合对药物体内过程相关性质的预测，筛选可能功效物质和活性分子。在TCMSP平台中，设置参数ALogP<5和DL≥0.18作为筛选条件。结合相关文献[3]，在板蓝根中补充腺苷这一成分，通过检索中药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/search/)并链接到PubChem Compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)获得相应分子信息，包括分子名称、InChI Key、WM、辛醇-水分配系数(XLogP3)、Hdon、Hacc、RBN、TPSA和分子结构。

1.2 分子互作靶标和疾病信息的收集及靶标相应基因的获取

检索TCMSP数据库获得金银花、板蓝根所预测活性分子的靶标；根据所获靶标，进一步检索TCMSP数据库获得靶标相关的疾病。另外，板蓝根中腺苷对应的靶标和疾病通过TCMID数据库获得。靶标相应基因通过Uniprot(http://www.uniprot.org/)获取，检索Uniprot中的UniprotKB数据库，检索式为“organism：‘homo sapiens’ AND reviewed：yes”。将检索结果以Excel格式导出，即获得UniprotKB/Swiss-Prot数据库中人类的相关靶蛋白及其对应基因的记录。利用Excel软件的“VLOOKUP”函数匹配所获得靶标对应的基因信息。非蛋白质的靶标或其他致病菌中的靶标，通过检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者利用多种搜索引擎检索获得。

1.3 网络构建与网络分析

将“金银花-板蓝根”的药物、成分、作用靶标和相关疾病导入Cytoscape 3.4.0软件(http://www.cytoscape.org/)构建其“药物-成分-靶标-疾病”网络，然后利用Cytoscape 3.4.0软件的NetworkAnalyzer工具计算网络拓扑参数，包括度值(Degree)、介数(betweenness centrality，BC)等[4-6]。在生物网络中，Degree指一个节点与其他节点相连的边的数目[7]；BC指网络所用的最短路径中经过当前节点的数目，反映节点在特定网络拓扑结构中所处位置的枢纽程度[8]。利用节点Degree及BC排序确定网络关键节点是目前网络分析的主要策略之一[7]。因此，本研究采用该网络分析方法，确定关键节点，探讨“金银花-板蓝根”的主要作用靶标、主治疾病及其作用机制。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)分类富集分析

GO是主要为了统一表征所有物种的基因及基因产物的性质而发起的生物信息学计划[9]。GO数据库(www.geneontology.org)旨在建立一套适用于所用物种的、对基因和蛋白质功能进行限定和描述的、并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO有3个分类：(1)分子功能(molecular function，MF)，描述基因产物在分子生物学上的活性，如催化活性或结合活性；(2)生物学过程(biological process，BP)，指由分子功能有序组成的，具有多个步骤的一个过程；(3)细胞组分(cell component，CC)，指基因产物位于何种细胞器或基因产物组中(如糙面内质网、核或核糖体及蛋白酶体等)，表明基因产物在什么地方起作用。GO的结构是个有向无环图，每个语义多在自己的类别中与其他语义相关联，有时会与其他类别的语义相关联；语义之间的关系为“is a”或“part of”。利用Cytoscape 3.4.0软件Apps中的BiNGO 3.0.3对“金银花-板蓝根”药对对应的基因分别进行GO分类富集分析[10-11]。BiNGO Settings面板的参数设置如下：簇名分别命名为“DZ-MF”“DZ-BP”和“DZ-CC”；选择“paste genes from text”，将基因名称复制粘贴到输入框中，每个基因单独占一行；输出内容和方式依次选择“overrepresentation”“visualization”和“overrepresented categories after correction”，参照集合选择“use whole annotation as reference set”，物种选择“Homo Sapiens”，以Cytoscape层次网络图形式输出该基因集合相较于人类基因组比例更高的GO分类注释；选择“Hypergeometric test”的统计方法和“Benjamini & Hochberg False Discovery Rate(FDR)correction”的P校正法，设置显著性水平为P<0.01；分别选择“GO_Molecular_Function”“GO_Cellular_Component”和“GO_Biological_Process”进行GO-MF、GO-CC和GO-BP的富集分析。

1.5 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8数据库(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)进行通路富集分析[12]。在DAVID的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，选择基因名称对应的基因标示符“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；为所提交的基因列表选择对应的物种“Homo Sapiens”，背景也选择“Homo Sapiens”，即以人类全基因组为背景基因和参照集合。选择分析工具“Functional Annotation Tool”，采用默认的阈值EASE=0.1 and Count=2(EASE Score的阈值指最大P，Count的阈值指与某一通路相关的基因数目的最小值，统计检验基于modified Fisher Exact法)，可获得通路富集结果，点击链接可以查看KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)中对应的通路图及其详情。

2 结果

2.1 化学成分分子信息分析

“金银花-板蓝根”药对共筛选出92个药物分子，主要包括黄酮类、绿原酸类化合物、吲哚/喹唑酮/喹啉/异喹啉生物碱类、环烯醚萜苷类、芥子苷类和木脂素类等。其中，64个(占69.6%)分子符合“Lipinski’s rule of five”；21个分子的BBB>-0.3且TPSA<90Å2，分别为C0006(Ineketone)、C0010(靛蓝)、C0011[2-(2,4-dimethoxyphenyl)-3-hydroxy-7-methoxy-chromone]、C0012[(2Z)-2-(2-oxoindolin-3-ylidene)indolin-3-one]、C0017(刺槐素)、C0021[6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one]、C0024[5-hydroxy-7-methoxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)chromone]、C0025(DFV)、C0028(Sinoacutine)、C0030(松脂醇)、C0031[2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-chromone]、C0038[(E)-3-(3,5-dimethoxy-4-hydroxy-benzylidene)-2-indolinone]、C0042{(E)-2-[(3-indole)cyanomethylene-]-3-indolinone}、C0060(甜橙黄酮)、C0061(Crysophanol)、C0064(Flavone der.)、C0065{3-[(3,5-dimethoxy-4-oxo-1-cyclohexa-2,5-dienylidene)methyl]-2,4-dihydro-1H-pyrrolo[2,1-b]quinazolin-9-one}、C0069(secologanic dibutylacetal_qt)、C0084(quindoline)、C0097[(E)-3-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyb-enzylidene)]和C0101(色胺酮)，提示这21个分子可能具有一定的BBB穿透性。利用SPSS 20.0软件对“金银花-板蓝根”药对91个药物分子(不包括腺苷，即C0072)的分子信息进行统计描述，结果显示，91个药物分子的均值符合“Lipinski’s rule of five”，且DL≥0.18，见表1；同时，腺苷(C0072)也符合“Lipinski’s rule of five”，说明92个药物分子总体具有较好的DL。

表1 “金银花-板蓝根”药对91个药物分子(腺苷除外)的 分子信息统计结果 Tab 1 Statistical results of information of the 91 drug molecules(except for adenosine)of “lonicerae japonica-radix isatidis” herb couple

2.2 “药物-成分-靶标-疾病”网络分析

“金银花-板蓝根”药对的“药物-成分-靶标-疾病”网络见图1，该网络图含有1 368个节点(2个药物，92个成分，665个靶标，609种疾病)和2 469条边线，节点大小、节点名称字号大小与Degree呈正相关，连线粗细与EdgeBetweenness呈正相关。采用Degree和BC排序确定关键节点，网络中Degree≥20的成分、靶标和Degree≥5疾病节点见表2。由图1、表2可见，在“金银花-板蓝根”药对网络中：(1)Degree≥20的化合物分子共16个(占17.4%)，其中腺苷、槲皮素和芹菜素的Degree分别为439、151和82，远高于其他化合物节点，可能为网络中关键节点。(2)Degree≥20的关键靶标24个(占3.6%)，包括前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，COX-2)、热休克蛋白90α(heat shock protein HSP 90-alpha，HSP86)、前列腺素内过氧化物合酶1(prostaglandin G/H synthase 1，COX-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、凝血酶原、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP-4)、雄激素受体、5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，5-LOX)、β2肾上腺素能受体、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、DNA拓扑异构酶2α、凝血因子X、蛋白激酶A催化亚基C-α(mRNA of PKA catalytic subunit C-alpha，PKA C-α)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶催化亚基γ亚型(phosphatidylinositol 4,5-bisp-hosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform，PI3K-γ)、胰蛋白酶-1、细胞核受体共激活剂2(nuclear receptor coactivator 2，NCoA-2)、钙调蛋白(calmodulin，CaM)、诱导型一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase，inducible，iNOS)、钠通道蛋白5型亚基α(sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、内皮型一氧化氮合酶3(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2，CA-Ⅱ)和丝裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK 14)。(3)Degree≥5的疾病23种(占3.8%)，包括恶性肿瘤、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、实体瘤、非小细胞肺癌及肺癌等肿瘤，心血管疾病、高血压病、心力衰竭及心肌梗死等循环系统疾病，非胰岛素依赖型糖尿病、肥胖等代谢性疾病，阿尔茨海默病、帕金森病等中枢神经系统疾病，精神分裂症、焦虑症等精神行为障碍，哮喘、炎症、疟疾、疼痛及骨关节炎等。

图1 “金银花-板蓝根”药对的“药物-成分-靶标-疾病”网络 Fig 1 “Drug-composition-target-disease” network of “lonicerae japonica-radix isatidis” herb couple

2.3 GO分类富集分析

通过BiNGO获得了“金银花-板蓝根”药对的基因集合中645个基因的分子功能注释信息，641个基因的细胞组分注释信息，638个基因的生物学过程注释信息。进一步对以上基因注释信息进行分类富集分析：(1)GO-MF获得235条富集结果，其层次网络见图2(节点大小代表基因数量多少，颜色深浅代表P大小)，主要涉及跨膜受体活性、G-蛋白耦连受体活性、分子传感器活性、受体活性、受体结合、蛋白结合、嘌呤核苷酸 结合、腺嘌呤核苷酸结合、酶结合、ATP结合和催化活性等方面；(2)GO-CC获得78条富集结果，其层次网络见图3(节点大小代表基因数量多少，颜色深浅代表P大小)，主要涉及细胞膜固有组分、细胞膜必需组分、细胞膜、细胞外间隙、细胞外区域、细胞碎片、不溶性碎片、细胞质基质、膜、内质网和线粒体等方面；(3)GO-BP获得1 367条富集结果，其层次网络过于复杂庞大，未在文中表示，仅列出其中P<0.01且基因数量百分比≥10.0%的前20条注释信息，主要涉及细胞表面受体相关信号通路、化学刺激响应、信号通路、信号传递、信号转导、生物过程、细胞过程、多细胞生物过程、生物过程调控、细胞过程调控、发育过程、代谢过程、细胞代谢过程、初级代谢过程、代谢过程调控和多细胞代谢过程调控等方面，见表3。

表2 “金银花-板蓝根”药对的“药物-成分-靶标-疾病” 网络节点及其参数(分子和靶标节点Degree≥20，疾病 节点Degree≥5) Tab 2 Nodes and parameters of “drug-composition- target-disease” network of “lonicerae japonica-radix isatidis” herb couple(Degree of molecules and targets nodes ≥20, degree of diseases nodes ≥5)

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库对“金银花-板蓝根”药对的基因集合进行KEGG通路富集分析，阈值参数设置为EASE=0.05，Count=10，共获得137条富集结果。其中EASE<0.05，Count≥10，FDR<0.01的前20条通路主要包括5条信号传导相关通路，1条代谢通路，7条生物系统相关通路(涉及免疫系统、内分泌系统、消化系统、感觉系统及循环系统)和7条疾病通路(肿瘤和感染性疾病)，具体为神经活性配体-受体相互作用通路、环磷腺苷信号通路、钙离子信号通路、环磷鸟苷-蛋白激酶G信号通路、TNF信号通路、嘌呤代谢通路、趋化因子信号通路、脂肪细胞脂解作用调控通路、雌激素信号通路、催产素信号通路、唾液分泌通路、瞬时受体电位通道的炎症介质调控通路、心肌细胞的肾上腺素能信号通路、恶性肿瘤通路、乙型肝炎通路、胰腺癌通路、前列腺癌通路、美洲锥虫病通路、膀胱癌通路和神经胶质瘤通路，见表4。

3 讨论

网络药理学研究策略具有整体性、系统性的特点，这与中医药整体观与辨证论治的原则不谋而合[13]，已有诸多研究应用网络药理学方法进行中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述[14-17]。本研究采用网络药理学方法，构建了“金银花-板蓝根”药对的“药物-成分-靶标-疾病”网络，从整体角度体现出了“金银花-板蓝根”药对多成分、多靶标和多途径的治疗机制。进一步通过网络拓扑学分析，发现该网络同样具备部分无标度、小世界的网络特性，说明网络中存在关键节点。

网络关键节点分析结果表明，“金银花-板蓝根”药对中的活性成分可能通过调控某些关键靶标而对多种疾病发挥治疗作用。与炎症、肿瘤密切相关的靶标COX-2的Degree为96，远高于其他靶点节点，推测“金银花-板蓝根”药对可能通过调控关键靶标COX-2对多种炎症、疼痛和肿瘤等疾病中发挥作用，这与已有研究结果一致。COX-2是花生四烯酸代谢过程中调节前列腺素合成的限速酶，主要引起炎症反应。王萍等[18]研究表明，金银花能抑制前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、TNF-α过表达，减轻宫颈黏膜坏死程度，对大鼠宫颈炎具有一定疗效。另外，金银花提取物能抑制PGE2的合成或释放，提示金银花提取物的抗炎作用可能与其抑制COX-2的活性，进而阻滞炎性介质前列腺素的合成与释放有关[19]。板蓝根70%乙醇提取部位在抗炎、镇痛活性上均显示出较强的作用，其机制可能与抑制炎性因子PGE2及TNF-α释放有关[20]。

图2 “金银花-板蓝根”药对相应基因GO分子功能分类的层次网络 Fig 2 Hierarchical network of GO classified molecular function of “lonicerae japonica-radix isatidis” herb couple related genes

图3 “金银花-板蓝根”药对相应基因GO细胞组分分类的层次网络 Fig 3 Hierarchical network of GO classified cellular compositions of “lonicerae japonica-radix isatidis” herb couple related genes

表4 “金银花-板蓝根”药对相应基因KEGG通路富集分析(EASE<0.05，Count≥10，FDR<0.01的前20条通路) Tab 4 KEGG pathway enrichment analysis of “lonicerae japonica-radix isatidis” herb couple related genes(the first 20 pathways with EASE<0.05, Count≥10 and FDR<0.01)

“金银花-板蓝根”药对的KEGG通路富集结果表明，其绝大部分基因富集在与恶性肿瘤直接相关的信号通路上，包括恶性肿瘤通路、胰腺癌通路、前列腺癌通路、膀胱癌通路及神经胶质瘤通路等，提示“金银花-板蓝根”药对可能会在多种恶性肿瘤的治疗方面发挥一定的作用。另有多数基因富集在与心脏活动密切相关的信号通路上，如环磷腺苷信号通路、钙离子信号通路、环磷鸟苷-蛋白激酶G信号通路及心肌细胞的肾上腺素能信号通路，且结合之前“药物-成分-靶标-疾病”网络关键节点的分析结果，心力衰竭、心肌梗死和高血压病等心血管疾病为该药对生物网络的关键疾病节点，推测心脏可能是“金银花-板蓝根”药对作用的靶器官，这与中医药中金银花、板蓝根均入心经的特点不谋而合，同时表明“金银花-板蓝根”药对可能通过上述信号通路在心血管疾病中发挥治疗作用，值得进一步研究。

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