基于网络药理学的“胆酸-猪去氧胆酸”作用机制研究Δ

吴嘉瑞，蔺梦娟，刘鑫馗

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

清开灵注射液在古方安宫牛黄丸的基础上研制而成，“胆酸-猪去氧胆酸”为其重要药物组合。胆酸、猪去氧胆酸为牛黄的替代品，牛黄味苦性凉，善清心肝之邪热，能清心解毒、息风定惊、豁痰开窍而醒神；牛黄的主要成分为胆酸与去氧胆酸，而猪去氧胆酸为异去氧胆酸，效用与去氧胆酸相似，因此胆酸、猪去氧胆酸共为清开灵注射液的君药[1-2]。以往多采用动物实验、细胞实验等方法对中药的某一作用机制进行研究，难以获得中药作用机制网络的整体面貌。近年来，网络药理学融合系统生物学、多向药理学、生物信息学和计算机科学等多学科的技术和内容，进行“疾病表型-基因-靶点-药物”等多层次网络的构建，探索药物与疾病间的关联性，指导新药研发，阐明药物作用机制，其整体性、系统性及复杂性的研究视角和研究方法，与中医药的特点不谋而合[3]。因此，本研究基于网络药理学方法，通过构建“胆酸-猪去氧胆酸”的“药物-成分-靶标-疾病”多层次生物网络，结合基因功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，开展清开灵注射液的作用机制研究。

1 资料与方法

1.1 药物分子信息的收集和活性分子的筛选

通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)获得胆酸的分子信息，包括分子名称、InChI Key、相对分子质量(molecular weight，WM)、辛醇-水分配系数(AlogP)、氢键配位电子供体数目(Hdon)、氢键配位电子受体数目(Hacc)、可旋转键数目(RBN)、分子极性表面积(TPSA)、类药性(drug-likeness，DL)、血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)、半衰期(half life，HL，t1/2)和分子结构。通过检索PubChem Compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)，获得猪去氧胆酸的主要成分猪去氧胆酸的分子信息，包括分子名称、InChI Key、WM、辛醇-水分配系数(XLogP3)、Hdon、Hacc、RBN、TPSA和分子结构。

1.2 分子互作靶标和疾病信息的收集

通过检索TCMSP数据库获得胆酸的作用靶标，根据所获靶标，进一步检索TCMSP数据库获得靶标相关的疾病。利用PubChem BioActivity Analysis Service(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi)获得猪去氧胆酸分子的作用靶标，在TCMSP数据库中检索获得靶标相关的疾病。

1.3 靶标相应基因的获取

检索Uniprot(http://www.uniprot.org/)中的UniprotKB数据库，检索式为“organism：‘homo sapiens’ AND reviewed：yes”。将检索结果以Excel格式导出，即获得UniprotKB/Swiss-Prot数据库中人类的相关靶蛋白及其对应基因的记录。利用Excel软件的“VLOOKUP”函数匹配“1.2”项中所获得靶标对应的基因信息。非蛋白质的靶标或其他致病菌中的靶标，通过检索美国国立生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者利用多种搜索引擎检索获得。

1.4 网络构建与网络分析

将“胆酸-猪去氧胆酸”的药物、成分、作用靶标和相关疾病导入Cytoscape 3.4.0软件(http://www.cytoscape.org/)构建其“药物-成分-靶标-疾病”网络，利用Cytoscape 3.4.0软件的NetworkAnalyzer工具计算网络拓扑参数，包括度值(Degree)，介数(betweenness centrality，BC)等[4-6]。在生物网络中，Degree指1个节点与其他节点相连的边的数目[7]；BC指网络所用的最短路径中经过当前节点的数目，反映节点在特定网络拓扑结构中所处位置的枢纽程度[8]。利用节点Degree及BC排序确定网络关键节点是目前网络分析的主要策略之一[7]。因此，本研究采用该网络分析方法，确定关键节点，探讨“胆酸-猪去氧胆酸”的主要作用靶标、主治疾病及其作用机制。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)分类富集分析

GO是主要为了统一表征所有物种的基因及基因产物的性质而发起的生物信息学计划[9]。GO数据库(www.geneontology.org)旨在建立一套适用于所用物种的、对基因和蛋白质功能进行限定和描述的、并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO有3个分类：(1)细胞组分(cell component，CC)，指基因产物位于何种细胞器或基因产物组中(如糙面内质网、核或核糖体和蛋白酶体等)，表明基因产物在什么地方起作用；(2)分子功能(molecular function，MF)，描述基因产物在分子生物学上的活性，如催化活性或结合活性；(3)生物学过程(biological process，BP)，指由分子功能有序组成的，具有多个步骤的一个过程。GO的结构是个有向无环图，每个语义多在自己的类别中与其他语义相关联，有时会与其他类别的语义相关联；语义之间的关系为“is a”或“part of”。利用Cytoscape 3.4.0软件Apps中的BiNGO 3.0.3对“胆酸-猪去氧胆酸”对应的基因分别进行GO分类富集分析[10-11]。BiNGO Settings面板的参数设置如下：簇名分别命名为“DZ-MF”“DZ-BP”和“DZ-CC”；选择“paste genes from text”，将基因名称复制粘贴到输入框中，每个基因单独占一行；输出内容和方式依次选择“overrepresentation”“visualization”和“overrepresented categories after correction”，参照集合选择“use whole annotation as reference set”，物种选择“Homo Sapiens”，以Cytoscape层次网络图形式输出该基因集合相较于人类基因组比例更高的GO分类注释；选择“Hypergeometric test”的统计方法和“Benjamini & Hochberg False Discovery Rate(FDR)correction”的P校正法，设置显著性水平为P<0.01；分别选择“GO_Molecular_Function”“GO_Cellular_Component”和“GO_Biological_Process”进行GO-MF、GO-CC和GO-BP的富集分析。

1.6 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8数据库(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)进行通路富集分析[12]。在DAVID的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，选择基因名称对应的基因标示符“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；为所提交的基因列表选择对应的物种“Homo Sapiens”，背景也选择“Homo Sapiens”，即以人类全基因组为背景基因和参照集合。选择分析工具“Functional Annotation Tool”，采用默认的阈值EASE=0.1 and Count=2(EASE Score的阈值指最大P，Count的阈值指与某一通路相关的基因数目的最小值，统计检验基于modified Fisher Exact法)，可获得通路富集结果，点击链接可以查看KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)中对应的通路图及其详情。

2 结果

2.1 化学成分分子信息分析

“胆酸-猪去氧胆酸”的2个主要成分胆酸和猪去氧胆酸均符合“Lipinski’s rule of five”[13-14]，且胆酸的DL=0.72>0.18，表明2个成分均具有较好的DL[6，15]；胆酸的BBB=-1.06<-0.3，TPSA=97.99 Å2>90Å2，提示其BBB穿透性较差[15-16]；而猪去氧胆酸的TPSA=77.8Å2<90Å2，提示其可能具有一定的BBB穿透性，见表1。

表1 “胆酸-猪去氧胆酸”的分子信息

注：“—”表示无相关数据

Note：“—”means no relevant data

2.2 “药物-成分-靶标-疾病”网络分析

“胆酸-猪去氧胆酸”的“药物-成分-靶标-疾病”网络见图1，共包含18个节点(2个药物，2种成分，6个靶标，8种疾病)和17条边线，不同节点分别代表药物、成分、靶标和疾病，边线表示各节点之间的相互作用关系。通过节点的Degree和BC排序确定关键节点，“胆酸-猪去氧胆酸”的“药物-成分-靶标-疾病”网络节点及其参数(Degree≥2)见表2。由图1、表2可见，“胆酸-猪去氧胆酸”的2个主要成分胆酸和猪去氧胆酸共涉及6个靶标，其中，盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)、肝X受体-α氧化型胆固醇受体(oxysterols receptor LXR-alpha，LXRα)和肝X受体-β氧化型胆固醇受体(Oxysterols receptor LXR-beta，LXRβ)等3个靶标的Degree和BC较高，每个靶标均与多种疾病相关。前者与脑损伤、妊娠期早发性高血压、假性Ⅰ型低醛固酮血症、高血钾型肾小管性酸中毒等循环和泌尿系统疾病有关；后两者与动脉粥样硬化、血脂异常等循环、代谢性疾病有关。

图1 “胆酸-猪去氧胆酸”的“药物-成分-靶标-疾病”网络 Fig 1 “Drug-composition-target-disease” network of “cholic acid-hyodeoxycholic acid”

节点名称DegreeBCT0755MR60.8333C0018猪去氧胆酸40.6190C0005胆酸40.5833T0885LXRα30.3571T0886LXRβ30.3571D0204动脉粥样硬化20.0952

2.3 GO分类富集分析

通过BiNGO获得了“胆酸-猪去氧胆酸”的基因集合中5个基因的分子功能、细胞组分注释信息和4个基因的生物学过程注释信息。进一步对以上基因注释信息进行分类富集分析：GO-MF获得19条富集结果，其层次网络见图2，其中“P<0.01且基因数量百分比≥50.0%”的注释信息见表3；GO-CC获得0条富集结果；GO-BP获得68条富集结果，其层次网络见图3，其中前20条“P<0.01且基因数量百分比≥50.0%”的注释信息见表4。在图2—3中，节点代表基因的功能注释，节点面积越大表示其对应基因的数量越多，节点颜色越深表示其P越小，差异越具有统计学意义。可见，各分子功能或生物学过程注释之间形成复杂网状结构，为有向无环图，各节点间既有隶属关系，也存在平行关系。GO分类富集分析的结果显示，“胆酸-猪去氧胆酸”的基因集合分别富集在类固醇激素受体活性、配体依赖核受体活性、信号传导活性、分子传感器活性及转录激活活性等分子功能上和胞饮负调控、三酰甘油生物合成正调控、胆固醇储存负调控、脂蛋白酯酶活性正调控及胆固醇流出正调控等生物学过程中。

图2 “胆酸-猪去氧胆酸”相应基因GO分子功能 分类的层次网络 Fig 2 Hierarchical network of GO classified molecular function of “cholic acid-hyodeoxycholic acid” related genes

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库对“胆酸-猪去氧胆酸”的基因集合进行KEGG通路富集分析，结果显示，“胆酸-猪去氧胆酸”的KEGG通路富集于1个疾病通路和1个信号通路中，分别为胰岛素抵抗疾病通路和甲状腺激素信号通路，见表5。

3 讨论

为了从系统层面研究“胆酸-猪去氧胆酸”的作用机制，本研究构建了“胆酸-猪去氧胆酸”的“药物-成分-靶标-疾病”网络，分析了药物成分、靶标与疾病之间的相互作用关系，并对其对应基因进行了GO分类功能富集分析和KEGG通路富集分析，为揭示“胆酸-猪去氧胆酸”多成分、多靶点和多途径的治疗机制提供了参考。

通过网络拓扑学分析，所获得的关键靶标为MR、LXRα和LXRβ，三者均属于核受体家族。(1)MR是盐皮质激素如醛固酮和糖皮质激素如皮质酮、皮质醇的作用靶标。盐皮质激素具有促进肾小管重吸收钠而保水、排钾的主要生理作用；醛固酮是作用最强的天然盐皮质激素，其分泌过高可能引起组织水肿、高血压、低血钾等[17]。推测清开灵注射液中的胆酸可能通过作用于MR，影响机体水、电解质代谢，从而在脑损伤、妊娠期早发性高血压、假性Ⅰ型低醛固酮血症、高血钾型肾小管性酸中毒等循环和泌尿系统疾病中发挥作用。(2)LXR有LXRα和LXRβ2种亚型，两者的表达具有组织特异性，LXRα在肝脏表达最高，LXRβ在脑部表达最高，两者均在胆固醇的吸收、排出及转化和脂肪酸的合成等多方面发挥调节作用[18]。LXR具有在肝脏调控胆固醇的分解、在肝外组织促进胆固醇的酯化储存与向肝脏的逆转运、抑制小肠过度吸收胆固醇等生理功能。在机体内，巨噬细胞或平滑肌细胞若吞噬了过量的胆固醇，则容易变为泡沫细胞，泡沫细胞常见于高胆固醇血症患者及动脉粥样硬化患者的粥样斑块内。而且，高胆固醇血症也会增加血浆和动脉组织中氧化型胆固醇的含量，而氧化型胆固醇对内皮细胞、平滑肌细胞及单核/巨噬细胞均有细胞毒性，且可以抑制胆固醇向肝脏的逆转运，促进泡沫细胞和动脉粥样斑块的形成。LXR促进胆固醇的逆转运等生理功能在减少和防止血脂异常和动脉粥样硬化等疾病形成和发展中具有重要意义[18-19]。已有药品猪去氧胆酸片用于Ⅰa和Ⅰb型高脂血症和动脉粥样硬化的治疗，推测猪去氧胆酸可能通过作用于LXR受体，调节机体胆固醇的代谢、储存及转运等多个环节而对血脂异常和动脉粥样硬化等代谢、循环系统疾病发挥治疗作用。此外，结合药物分子性质预测，表明猪去氧胆酸具有一定的BBB穿透性，而LXRβ在脑部表达最高，对调节脑部胆固醇的含量和稳定等具有重要意义。脑是富含胆固醇的器官，胆固醇对维持脑神经元细胞的生理功能和结构稳定具有重要作用[18]。推测猪去氧胆酸可能通过作用于LXRβ受体对脑部疾病发挥治疗作用。

表3 “胆酸-猪去氧胆酸”相应基因GO分子功能富集分析结果(P<0.01且基因数量比≥50.0%)

图3 “胆酸-猪去氧胆酸”相应基因GO生物学过程分类的层次网络 Fig 3 Hierarchical network of GO classified biological processes of “cholic acid-hyodeoxycholic acid” related genes

GO-IDGO生物学过程注释PP(校正后)基因48550胞饮负调控5.86×10-89.38×10-6NR1H2|NR1H348548胞饮调控3.52×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H310867三酰甘油生物合成正调控5.86×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H310866三酰甘油生物合成调控8.79×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H310887胆固醇储存负调控8.79×10-72.81×10-5NR1H2|NR1H351006脂蛋白酯酶活性正调控1.64×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H310875胆固醇流出正调控1.64×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H332373固醇转运正调控2.11×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H332376胆固醇转运正调控2.11×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H310874胆固醇流出调控2.11×10-63.38×10-5NR1H2|NR1H390208三酰甘油代谢正调控3.22×10-64.30×10-5NR1H2|NR1H345723脂肪酸生物合成正调控3.22×10-64.30×10-5NR1H2|NR1H310885胆固醇储存调控3.87×10-64.76×10-5NR1H2|NR1H390207三酰甘油代谢调控4.57×10-64.87×10-5NR1H2|NR1H310745巨噬细胞源性泡沫细胞分化负调控4.57×10-64.87×10-5NR1H2|NR1H310888脂质储存负调控5.33×10-65.33×10-5NR1H2|NR1H332369脂质转运负调控6.15×10-65.79×10-5NR1H2|NR1H345806内噬负调控7.96×10-67.08×10-5NR1H2|NR1H342304脂肪酸生物合成调控1.00×10-58.01×10-5NR1H2|NR1H332370脂质转运正调控1.00×10-58.01×10-5NR1H2|NR1H3

表5 “胆酸-猪去氧胆酸”相应基因KEGG通路富集 分析(EASE<0.1，Count≥2) Tab 5 KEGG pathway enrichment analysis of “cholic acid-hyodeoxycholic acid” related genes(EASE<0.1, Count≥2)

注：FDR为错误发现率；基因数量比均为40%

Note：FDR means false discovery rate；percentage of genes≥40%

通过对“胆酸-猪去氧胆酸”的基因集合及其功能注释进行GO分类功能富集分析和KEGG通路富集分析，发现：(1)基因功能主要体现在胞饮调控、三酰甘油生物合成调控、胆固醇储存调控、脂蛋白酯酶活性调控及胆固醇外排调控等生物学过程和受体活性、信号转导活性、分子传感器活性及转录激活活性等分子功能方面，这与LXRα和LXRβ作为转录因子，与配体结合激活后，作用于下游基因，上调相关基因的转录表达，调节机体胆固醇的代谢的认识相一致[18]；(2)KEGG通路主要包括胰岛素抵抗信号通路和甲状腺激素信号通路。胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性地分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定，而胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2型糖尿病[20]。清开灵注射液能降低2型糖尿病并发虹膜睫状体炎患者血总胆固醇、三酰甘油和纤维蛋白原水平，推测这种调节功能可能与“胆酸-猪去氧胆酸”作用于胰岛素抵抗信号通路中的NR1H2和NR1H3基因及LXR受体有关[21]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对“胆酸-猪去氧胆酸”的多成分、多靶点与多种疾病间复杂网状关系进行研究。研究结果初步验证了“胆酸-猪去氧胆酸”的基本药理学作用和相关机制，并为进一步深入探讨其作用机制奠定了良好的基础。

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