米根霉分批补料一步发酵法高效积累L-乳酸的研究＊

孙小龙 ，陈 耀 ，付永前 ，

（1.台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000；2.浙江金晟环保股份有限公司，浙江 台州 317300）

0 引言

L-乳酸作为生产绿色环保原料乳酸乙酯以及生物降解塑料-聚乳酸的单体，而越来越引起人们的重视［1］。合成L-乳酸的方法有很多，主要有化学合成法、酶法生产以及发酵法生产［2-4］。其中根霉菌，尤其是米根霉，因其在发酵生产L-乳酸过程中具有自身独特的优势：高效、安全、环保等，而越来越多的应用于L-乳酸的合成研究中［5，6］。目前米根霉合成L-乳酸由于较低的生产效率而难以应用于工业化生产［7，8］，为了提高米根霉合成L-乳酸的生产效率，大量工作致力于高产菌株的筛选、菌体形态控制、利用低价的原料以及新型生物反应器等的研究［4，9-11］。然而，在绝大多数利用米根霉发酵合成L-乳酸的研究中，乳酸的产量和生产效率多数在60-120.0 g/L和0.7-2.5 g/L/h之间，远低于乳酸菌的生产效率［8，12，13］。部分研究尝试通过菌丝球或固定化细胞方法达到令人满意的生产水平［14，15］，如，Efremenko等［14］提出，利用PVA凝胶固定化细胞可最大化的提高米根霉发酵产乳酸的生产效率，但是，这种摇瓶培养技术并不适用大规模的 L-乳酸生产［8，12］。

为了提高米根霉合成乳酸的生产效率，本课题组创新性的提出了米根霉一步发酵高通量合成L-乳酸的策略［7］，在该策略条件下，米根霉发酵阶段L-乳酸的产量和生产效率分别达到了158.0 g/L和5.54 g/（L·h）。同时研究发现，分批补料策略有利于米根霉一步发酵合成L-乳酸。目前，基本没有文献系统研究分批补料调控对米根霉一步发酵合成L-乳酸的影响。因此，本研究，将系统的研究米根霉一步发酵积累L-乳酸的体系下的分批补料调控策略，为米根霉高效积累L-乳酸的工业化生产提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 菌种

米根霉（Rhizopus oryzae）LA-UN-1（NRRL 395诱变菌株），台州学院生物质资源研究所保藏［8］。

1.2 实验试剂

葡萄糖（分析纯），磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钙，碳酸钙，均采购于广东汕头市西陇化工厂，琼脂，蛋白胨，尿素，硫酸铵，酵母膏，磷酸均由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.3 实验器材

恒温振荡器（太仓市实验设备厂），SBA-40C生物传感仪（山东微生物研究院），7.5L发酵罐（New Brunswick Scientific co.，bioflo 110系列），电子天平（赛多利斯），HPLC（戴安系列 Summit P 680）。

1.4 培养基

一步发酵培养基（g/L）：葡萄糖20.0-220.0（根据不同分批补料策略进行初糖浓度控制）；蛋白胨3.0；KH2PO40.2；MgSO4·7H2O 0.2；CaCO3过量。

1.5 培养方法

1.5.1 米根霉孢子悬浮液的制备

取米根霉菌丝体接种于PDA斜面培养基，随后置于恒温培养箱中30℃培养6-7 d，孢子成熟后用无菌水洗下孢子，用医用无菌棉过滤得到孢子悬浮液。采用血球板计数法调整孢子浓度为107个/mL，保藏于4℃的冰箱待用。

1.5.2 一步乳酸发酵培养［7］

在优化的7.5 L发酵罐内进行，工作体积为5.0 L，取浓度为107个孢子/mL的孢子液100 mL接入到发酵罐中进行发酵。一步发酵24 h进入产酸阶段，通过减少发酵罐中发酵液体积（减少到原体积的50%）来增加单位菌体生物量［7］，从而进入快速产酸阶段。整个过程中通气量、搅拌速度，培养温度分别控制在0.5 vvm、300 rpm和30℃，碳酸钙作为中和剂。以单批次，初始浓度为220 g/L的葡萄糖作为对照。在整个发酵过程中，不再添加葡萄糖，除了过量的CaCO3作为中和剂调节pH值在6.0左右。

所有的分批补料发酵（初始葡萄糖浓度分别为150.0，100.0，50.0和20.0 g/L）都是以单批次培养开始，在发酵过程中，当残糖降到5.0 g/L以下时，用浓度为400 g/L的葡萄糖母液进行调节。过量的CaCO3作为中和剂调节pH值在6.0左右。

1.6 分析方法

在样品5.0 mL中加入5.0 mL的1 mol/L的盐酸溶液，将混合液置于80℃的恒温水浴锅中至反应10 min，5000 rpm离心5 min后，取清液稀释定容至所需体积，用0.45 μm微滤膜抽滤清液，待用。

糖浓度的测定：SBA-40C生物传感分析仪测定。

细胞干重的测定：将培养物抽滤，并用蒸馏水洗涤3次，抽滤后，60℃烘干至恒重（含水量在4%以下），称重。

乳酸的测定：按文献［8］方法进行。HDLC检测方法：进样量20 uL；流动相0.005 M H2SO4，流速0.8 mL/min；温度 60℃。

1.7 动力学参数计算［7］

L-乳酸比生成速率（qp，h-1）通过方程式（1）来估计或拟合细胞生长（x，g/L）和 L-乳酸生产量（p，g/L）的数据拟合数据将用Origin绘图软件对分批发酵过程中的数据进行插值计算（时间间隔为0.1 h）得到。

1.8 LDH（乳酸脱氢酶）酶活测定

按文献［9］方法进行。每分钟催化1μmol/L NADH的酶量为一个酶活单位。蛋白浓度使用Bradford方法检测。

2 结果与讨论

2.1 单批次和分批补料对米根霉一步发酵合成L-乳酸的影响

在之前的研究中［7］，当总葡萄糖浓度达到220.0 g/L时，L-乳酸积累被强烈的抑制。因此，在这里，初始葡萄糖浓度为220.0 g/L的单批次发酵和不同初始葡萄糖浓度（150.0，100.0，50.0和20.0 g/L）但总糖浓度控制在220.0 g/L左右的分批补料发酵对米根霉一步发酵合成L-乳酸的影响进行了考察，其结果如图1所示。从图1A-E和表1所示，L-乳酸的合成不管是在单批次发酵还是分批补料发酵，都存在两个比较明显的阶段（这与之前研究［7］基本一致）。与单批次乳酸发酵相比，分批补料发酵不管是最后L-乳酸的产量，生产效率还是菌体生物量，都明显高于单批次发酵（单批次发酵在发酵阶段的乳酸产量、生产效率和菌体量仅仅只有101.0 g/L，2.52 g/（L·h）和6.85 g/L）。这也进一步验证了单批次发酵中细胞周边较高的渗透压不利于乳酸的合成［10］。

在分批补料发酵过程中，L-乳酸的产量，生产效率和糖酸转化率随着初始葡萄糖浓度的降低而增加（表1）。当初始葡萄糖浓度达到50.0 g/L时，产酸阶段的L-乳酸产量，生产效率以及糖酸转化率都达到最大，分别为160.0 g/L，6.15 g/（L·h）和0.82 g/g。与单批次发酵相比，L-乳酸产量，生产效率以及糖酸转化率分别提高了1.57，2.44和1.68倍。与此同时，该生产效率也要高于课题组之前的报道［7］（5.45 g/（L·h））。随着初始葡萄糖浓度的进一步降低，较低的初始葡萄糖浓度（20.0 g/L）并不有利于L-乳酸的积累，进一步对发酵过程进行研究发现，在发酵初始阶段，乳酸的产量和生产效率相对较高，但随着发酵的进行（达到37 h后），其葡萄糖消耗速率和乳酸生成速率开始下降，并逐渐低于其它分批补料调控方式。

为了更加深入的研究不同一步发酵策略对L-乳酸合成的影响，我们对L-乳酸比生成速率（qp）进行分析。这些参数将基于图1A-E中的数据，利用插值法进行计算，最终结果可见图1F。如图所示，发酵培养24 h后，分批补料发酵的qp都要高于单批次发酵，qp随着初始葡萄糖浓度的降低而增加，发酵培养37 h后，初始糖浓度为20.0 g/L的qp达到最高值随后开始下降，与此同时，其他发酵模式下的qp继续上升，并在培养43 h后达到最大。而此时始葡萄糖浓度为50.0 g/L时的qp最大。

图1 米根霉单批次和分批补料一步发酵曲线（A）单批次发酵，初始葡萄糖为220.0g/L；（B）分批补料发酵：初始葡萄糖浓度150.0g/l，发酵进行到47小时补糖70.0g/L，总糖为219.0g/L；（C）分批补料发酵：初始葡萄糖浓度100.0g/L，发酵进行到37，34和47小时，分别补糖45.0g/L，总糖为224.0g/L；（D）分批补料发酵：初始葡萄糖浓度50.0g/L，发酵进行到29，39和45小时，分别补糖60，60和55.0g/L，总糖为217.0g/L；（E）分批补料发酵：初始葡萄糖浓度20g/L，发酵进行到24，32，39和47小时，分别补糖50.0g/L，总糖为218.0g/L；（F）乳酸比合成速率（qp）。（□）残余葡萄糖浓度；（△）生物量；（○）L-乳酸。Fig．1 Time-course of L-LA production by R.oryzae one-step fermentation using batch and fed-batch culture strategies.（A）Batch culture with 220g/L initial glucose；（B）Fed-batch culture:Initial glucose concentration of 150g/L，with 70g/L of supplemental glucose fed in to the fermenter after 47h of fermentation，resulting in a total glucose concentration of 219 g/L；（C）Fed-batch culture（ Initial glucose concentration of 100g/L，with solutions of 45g/L glucose fed in to the fermenter at 37，43，and 47h，resulting in a total glucose concentration of 224g/L；（D）Fed-batch culture:Initial glucose concentration of 50 g/L，with two solutions of 60 g/L glucose added into the fermenter at 29 and 39h，and a solution of 55 g/L glucose added at 45h，resulting in a total glucose concentration of 217g/L；（E）Fed-batch culture:Initial glucose concentration 20/L，with 50g/L glucose added to the fermenter at 24，32，39 and 47h，resulting in a total glucose concentration of 218g/L；（F）Comparison of specific L-LA formation rate（qp）.（□）Residual glucose concentration；（△）Biomass；（○）L-LA production.

表1 不同一步发酵策略产乳酸参数对比Table．1 Comparisons of the parameters of L-LA one-step fermentation by R.oryzae using different culture strategies

在之前的研究中发现［8］，米根霉培养过程中的菌体生物量和菌球特性能影响L-乳酸的合成效率。在单批次发酵过程中（初始葡萄糖浓度为220.0 g/L），菌体培养24 h后，生物量较低（6.85 g/L），并且菌球光滑致密，该菌体形态不利于传氧传质，并最终影响L-乳酸的合成［15，16］；在分批补料发酵过程中，随着初始葡萄糖浓度的降低，菌体培养24 h后，生物量越来越大（分别为8.24，8.94和9.01 g/L），与此同时，形成的菌球越来越松散，松散的菌球有利于L-乳酸的合成；当初始葡萄糖浓度为20.0 g/L时，菌体形态呈现于菌球与絮状混合状态，该形态在发酵培养前37 h，有利于传氧传质，然而，随着发酵的进行，该形态将进一步增加发酵过程中溶液的黏稠度，从而进一步增加了传氧传质的阻力，并进一步降低L-乳酸的合成［17-19］。

在此基础上，对不同培养条件下，不同培养时间（24，36，43，50 h）的乳酸脱氢酶（LDH）酶活进行了分析比对（表2）。研究发现，在培养24 h后，分批补料发酵的LDH都明显高于单批次培养，与此同时，初始葡萄糖浓度为20.0 g/L的LDH最高，随着初始葡萄糖浓度的增加而递减，该结果进一步验证了较高的初始葡萄糖浓度会降低LDH活力和L-乳酸的积累［10，11］。初始浓度为20.0 g/L的LDH的酶活在发酵36 h后达到顶峰，而其他的初始葡萄糖浓度的LDH都是在43 h达到顶峰。与此同时，在此阶段，L-乳酸的生产效率也达到最大，随后，LDH酶活开始下降。研究发现，在发酵的所有阶段，低初始葡萄糖浓度的LDH酶活要高于高初始葡萄糖浓度，LDH酶活的变化规律基本相同（除了20.0 g/L），20.0 g/L初始葡萄糖LDH酶活在发酵36小时后迅速下降。以上结果也进一步验证了20 g/L初始葡萄糖浓度发酵前期有利于乳酸的积累，但后期由于环境的变化而影响L-乳酸的合成。

表2 不同一步发酵策略LDH酶活变化Table．2 LDH-specific activity for L-LA production by R.oryzae one-step fermentation using different culture strategies

2.2 分批补料发酵不同残糖控制模式对L-乳酸合成的影响

分批补料一步发酵过程中，控制初始葡萄糖浓度为50.0 g/L，考察不同残余葡萄糖浓度（0～60，0～30.0和30～60.0 g/L）控制方式对L-乳酸合成的影响，其结果见表1。如表1所示，当初始葡萄糖浓度恒定时，不同残余葡萄糖浓度的变化对L-乳酸的合成并未有明显的变化，由于可知，采用分批补料一步发酵高通量积累L-乳酸，后期残余葡萄糖浓度的变化，并不会对L-乳酸合成产生本质的影响。

3 结论

考察了不同分批补料发酵策略（不同初始葡萄糖浓度以及残余葡萄糖控制方式）对米根霉一步发酵合成L-乳酸的影响，并得到以下结论：

（1）分批补料发酵过程中，控制初始葡萄糖浓度在50.0 g/L时，得到了较高的L-乳酸产量（162.0 g/L）和生产效率（6.23 g/（L·h）），与前期工作相比，虽然L-乳酸产量和转化率并未有较大变化，但生产效率提高了14.3%；

（2）不同初始葡萄糖浓度会影响菌体生物量和菌体形态，并最终影响L-乳酸的合成，初始葡萄糖浓度为50.0 g/L时，培养得到的菌体最有利于L-乳酸的合成。当初始葡萄糖浓度过低时（20.0 g/L），虽然培养得到的菌体有利于前期L-乳酸的合成，但随着发酵的进行，发酵液越来越黏稠，而不利于传氧传质，并最终影响后期的L-乳酸的合成；

（3）初始葡萄糖浓度对L-乳酸的合成影响较大，残余葡萄糖浓度的调控，对米根霉分批补料发酵合成L-乳酸，并未有明显的变化。

总体来讲，分批补料策略，能提高米根霉一步发酵法合成L-乳酸的生产效率，是一种利用米根霉发酵生产L-乳酸的方便、经济的方法，该工艺的研究，将为传统的丝状真菌合成有机酸提供良好的思路。