NCLX介导的线粒体钙稳态对肝癌细胞生长的影响

金明朋 尹纯 尚英英 曹海燕 吉晓莹 任婷婷 邢金良 吴有盛

肝癌是目前全世界第6大常见癌症，也是全球癌症第4大死亡原因，每年约有841 000例新发病例和782 000例死亡病例［1］。我国是肝癌高发区，近年来肝癌在我国的发病率和死亡率呈逐年上升趋势［2］，严重威胁人民健康。线粒体通过调节细胞代谢等功能在癌症的发生发展中扮演重要角色。研究证实线粒体结构和功能改变在促进癌症发展中发挥重要作用［3］。在线粒体众多功能中，肿瘤细胞线粒体钙稳态的变化备受关注［4］。钙离子可调节细胞增殖、分化和凋亡等。已有研究表明，一些肿瘤细胞存在特定的Ca2+通道、泵或交换剂被上调或下调［5-6］。线粒体钠钙交换体 （mitochondrial Na+/Ca2+exchanger，NCLX）是线粒体钙流出的通道，在调控线粒体钙稳态中发挥重要作用［7］。上述结果提示NCLX表达可能与肝癌的发生发展密切相关，有可能成为肿瘤治疗的潜在靶点，但目前国内外尚未有关NCLX与肝癌关系的深入研究。本研究通过构建干涉和过表达NCLX的稳定转染肝癌细胞系，观察NCLX介导的线粒体钙稳态在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用，初步探索线粒体钙对肝癌细胞生长的影响，为寻找肝癌的潜在治疗靶点提供证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

肝癌细胞系SNU-739和SNU-368购自上海中科院细胞库。NCLX扩增引物由上海生工合成，pcDNA3.1（+）载体、pSilencer3.0载体、脂质体（Lipofectamine 2000）、Rhod-2-AM、PVDF 膜、胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司，限制性核酸内切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ、T4 DNA 连接酶、DNA marker DL2000、DH5a感受态细菌菌株购自日本TaKaRa公司，细胞培养瓶购自美国Corning公司，5×蛋白上样缓冲液、RIPA裂解液购自西安晶彩科技有限公司，抗NCLX多抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，羊抗兔二抗购自英国Abcam公司，EdU试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物公司，6孔、24孔、96孔板购自美国Axygene公司，共聚焦专用玻璃购自无锡耐思生物科技有限公司，激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 细胞培养

肝癌细胞SNU-739、SNU-368用含10%FBS的RPMI 1640细胞培养基，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中正常培养，取对数生长期细胞用于后续实验，细胞用胰蛋白酶消化、传代。

1.3 构建稳定干涉或过表达NCLX基因的肝癌细胞株

采用Lipofectamine 2000转染，肝癌细胞SNU-739和SNU-368各分为4组：SNU-739-shCtrl组、SNU-368-shCtrl组（分别用空载体shCtrl转染SNU-739和SNU-368细胞），SNU-739-shNCLX组、SNU-368-shNCLX组（用pSliencer3.0-shNCLX转染SNU-739和SNU-368细胞，构建干涉NCLX的SNU-739和SNU-368细胞）；SNU-739-EV组、SNU-368-EV组（用空载体EV转染SNU-739和SNU-368细胞），SNU-739-NCLX组、SNU-368-NCLX组（用 pcDNA3.1(+)-NCLX转染 SNU-739和SNU-368细胞，构建过表达NCLX的SNU-739和SNU-368细胞）。取适量对数生长期的肝癌细胞，接种于6孔培养板，使24 h后细胞培养板覆盖率为70%～80%。转染方式按照Lipofectamine 2000说明书进行，本实验采用4μg质粒和8μLLipofectamine 2000每孔进行转染。筛选稳定干涉和过表达NCLX克隆株：细胞转染48 h后，用胰蛋白酶消化，接种1/5细胞到6孔培养板中，加入含800 μg/mL G418的RPMI 1640培养基，每2～3 d更换1次筛选培养基。细胞出现单克隆时，挑取单克隆团后进行常规培养，鉴定筛选有效克隆。

1.4 免疫印迹法检测NCLX蛋白的表达

取待测的处于对数生长期细胞，PBS洗涤3遍，加入RIPA裂解液冰上孵育30 min，4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液。BCA蛋白定量试剂盒测定NCLX蛋白浓度后，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10 min使其变性。按每孔60 μg上样，SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF膜，在5%脱脂奶粉中室温封闭 1 h，加入一抗 NCLX 抗体（1∶1000）和 β-actin 抗体（1∶3 000）4℃孵育过夜，TBST充分洗膜 3次后加入羊抗兔二抗（1∶10 000），室温孵育 1 h，TBST 洗涤 3次后，采用ECL化学发光检测试剂盒检测NCLX蛋白的表达。用Image J软件分析，以目的蛋白条带灰度值和内参β-actin的蛋白条带灰度值比值确定目的蛋白的相对表达水平，每组实验重复3次。

1.5 Rhod-2-AM染色检测线粒体钙水平

取对数生长期细胞，以每孔2×104个细胞接种于25 mm玻底细胞培养皿中，将细胞置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养过夜。配制1 mmol/L的Rhod-2-AM 母液：50 μg Rhod-2-AM 粉末用 44.5 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，分装，-20℃避光密封保存。使用时用含Ca2+、Mg2+的HBSS缓冲液以4∶1 000的比例配制4 μmol/L工作液；取出细胞弃去培养基，用含Ca2+、Mg2+的 HBSS 缓冲液洗涤细胞 3 次；加入 600 μL Rhod-2-AM工作液，37℃孵育40 min，用HBSS缓冲液洗涤细胞3次，去除残留的Rhod-2-AM工作液，然后加入HBSS溶液覆盖细胞，37℃孵育30 min；用激光共聚焦显微镜检测细胞，激发波长545 nm，发射波长565 nm。

1.6 EdU检测细胞增殖能力

取对数生长期细胞，以每孔1～4×104个细胞接种于24孔板中，于培养箱中培养过夜。用细胞培养液1∶1 000稀释EdU溶液为50 μM EdU工作液；每孔加入500 μL EdU工作液，37℃孵育2h，PBS清洗细胞2次，加500 μL 4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min；加入 500 μL 2 mg/mL甘氨酸孵育5 min，然后用PBS清洗以中和多聚甲醛，加入500 μL 0.5%TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育10 min后用PBS清洗；加入提前配置好的1×Apollo®染色反应液400 μL避光孵育30 min，加入渗透剂后分别用甲醇和PBS洗涤；加1×Hoechst 33342反应液进行DNA染色，荧光显微镜拍照计数。

1.7 MTS实验检测细胞生长情况

取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为100 μL/孔，加入 96 孔板，2×103个/孔；5%CO2、37 ℃孵育 24 h，显微镜观察；每孔加入20 μL MTS溶液（5 mg/mL），继续培养2 h；在酶联免疫检测仪OD为490 nm处测量各孔的吸光值（OD值）。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

收集对数生长期细胞，用无EDTA胰酶消化，1 000 r/min离心5 min后收集细胞，弃上清液。用提前预冷的PBS洗涤细胞3次，1 000 r/min离心5 min；用400 μL 1×Binding Buffer缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度约为1×106个/mL；向上述细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC染料，轻轻混匀，4℃冰箱中避光条件下孵育15 min；加入10 μL PI染料，轻轻混匀，于4℃冰箱中避光条件下孵育5 min；1 h内用流式细胞仪检测。激发波长为488 nm。

1.9统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。服从正态分布且方差齐性的两组数据之间的比较使用独立样本t检验，否则采用Wilcoxon秩和检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 真核表达载体的构建结果

构建的真核表达载体pSliencer3.0-shNCLX、pcDNA3.1（+）-NCLX经华大基因生物公司测序确认，所构建的载体序列正确（图1），可用于后续实验。

图1 干涉和过表达NCLX载体测序结果

2.2 免疫印迹法检测NCLX蛋白的表达

免疫印迹法检测结果显示（图2），SNU-739-shCtrl组和SNU-739-shNCLX组蛋白表达量分别为0.96±0.03 和 0.59±0.09，差异有统计学意义（P=0.02）；SNU-739-EV组和SNU-739-NCLX组蛋白表达量分别为1.02±0.03和 1.47±0.10，差异有统计学意义（P=0.01）；SNU-368-shCtrl组和SNU-368-shNCLX组蛋白表达量分别为1.16±0.08和0.69±0.06，差异有统计学意义（P=0.01）；SNU-368-EV 组和 SNU-368-NCLX 组蛋白表达量分别为0.94±0.06和2.41±0.12，差异有统计学意义（P＜0.01），提示稳定干涉和过表达NCLX的肝癌细胞系构建成功。

图2 免疫印迹法检测肝癌细胞中NCLX蛋白的表达

2.3 Rhod-2-AM染色检测线粒体钙水平

Rhod-2-AM染色结果显示（图3），SNU-739-shCtrl组和SNU-739-shNCLX组的相对荧光值分别为0.97±0.03和 1.53±0.08，差异有统计学意义（P＜0.01）；SNU-739-EV组和SNU-739-NCLX组的相对荧光值分别为1.04±0.06和 0.67±0.06，差异亦有统计学意义（P=0.01）；SNU-368-shCtrl组和SNU-368-shNCLX组的相对荧光值分别为1.03±0.01 和 1.61±0.02，SNU-368-EV 组和 SNU-368-NCLX组的相对荧光值分别为1.00±0.03和0.46±0.06，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示干涉 NCLX后肝癌细胞线粒体钙明显增多，而NCLX过表达的肝癌细胞线粒体钙明显减少。

图3 线粒体钙Rhod-2-AM的染色结果

2.4 干涉和过表达NCLX对肝癌细胞生长的影响

MTS实验结果显示（图 4），SNU-739-shCtrl组和SNU-739-shNCLX组96 h时的相对应OD值分别为0.78±0.04 和 1.18±0.06，差异有统计学意义（P＜0.01）；SNU-739-EV组和SNU-739-NCLX组在96 h相对应的OD值分别为0.87±0.05和0.59±0.05，差异有统计学意义（P=0.02）；SNU-368-shCtrl组和 SNU-368-shNCLX在96 h相对应的OD值分别为0.70±0.03和1.01±0.03，差异有统计学意义（P＜0.01）；SNU-368-EV组和SNU-368-NCLX组在96 h相对应的OD值分别为0.76±0.04 和 0.52±0.01，差异有统计学意义（P＜0.01），提示干涉NCLX明显促进了肝癌细胞生长，而NCLX过表达则抑制肝癌细胞生长。

图4 干涉和过表达NCLX对肝癌细胞生长的影响

2.5 干涉和过表达NCLX对肝癌细胞增殖的影响

EdU增殖实验结果显示（图5），SNU-739-shCtrl组和SNU-739-shNCLX组的细胞增殖率分别为（27.04±1.94）%和（48.94±5.60）%，差异有统计学意义（P=0.02）；SNU-739-EV 组和 SNU-739-NCLX 组的细胞增殖率分别为（32.62±2.38）%和（23.44±1.28）%，差异有统计学意义（P=0.03）；SNU-368-shCtrl组和SNU-368-shNCLX组的细胞增殖率分别为（30.75±1.33）%和（40.33±1.45）%，差异有统计学意义（P＜0.01）；SNU-368-EV组和SNU-368-NCLX组的细胞增殖率分别为（28.67±2.40）%和（20.33±1.45）%，差异有统计学意义（P=0.04），提示干涉NCLX明显促进了肝癌细胞增殖，而NCLX过表达明显抑制肝癌细胞增殖。

图5 干涉和过表达NCLX对肝癌细胞增殖的影响

2.6 干涉和过表达NCLX对肝癌细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示（图6），SNU-739-shCtrl组和SNU-739-shNCLX组的细胞凋亡率分别为（8.07±0.44）%和（4.03±0.44）%，差异有统计学意义（P＜0.01）；SNU-739-EV组和SNU-739-NCLX组的细胞凋亡率分别为（8.23±0.34）%和（14.30±0.49）%，差异有统计学意义（P＜0.01）；SNU-368-shCtrl组和 SNU-368-shNCLX组的细胞凋亡率分别为（9.37±0.41）%和（3.60±0.20）%，差异有统计学意义（P＜0.01）；SNU-368-EV组和SNU-368-NCLX组的细胞凋亡率分别为（10.20±0.41）和（20.30±0.49），差异有统计学意义（P＜0.01），提示干涉NCLX抑制了肝癌细胞凋亡，而NCLX过表达则促进肝癌细胞凋亡。

图6 干涉和过表达NCLX对肝癌细胞凋亡的影响

3 讨论

线粒体的钙离子转运调节平衡是线粒体合成ATP和诱导细胞凋亡以外的又一重要功能，一方面，线粒体钙可调控细胞质内钙离子水平，并对钙信号振荡有缓冲作用［5，8-9］；另一方面，线粒体还可通过调节内部钙稳态进一步影响其他功能，如活性氧ROS生成、氧化磷酸化进程以及线粒体凋亡通路活化等，最终在细胞生存状态调节中发挥重要作用［10-11］。

NCLX是钠钙交换蛋白超家族的成员之一，该家族蛋白具有α1/α2重复结构形成催化阳离子的转运部件［12-13］。NCLX作为线粒体钙排出通道，在线粒体钙稳态调控过程中发挥作用。已有大量研究报道NCLX表达异常与多种疾病的发生和发展密切相关。在内分泌与代谢疾病相关研究中，高糖环境下敲低NCLX表达后，线粒体钙释放减少，葡萄糖依赖性胰岛素分泌延迟［8］。在心血管疾病相关研究中，美国坦普尔大学研究团队发现缺失NCLX表达的小鼠出生后14 d的存活率不到13%，致死原因多为心肌功能障碍和暴发性心力衰竭，证明了NCLX低表达能干扰线粒体稳态，进而严重影响心脏的正常功能［7］。在神经生物研究领域，有研究表明NCLX表达沉默会显著抑制星形胶质细胞的增殖和迁移能力［14］。本研究通过构建干涉和过表达NCLX肝癌细胞系，检测细胞线粒体钙水平，并通过增殖实验和凋亡实验分别检测细胞的增殖能力和凋亡情况，研究结果显示干涉NCLX诱导的线粒体钙水平升高促进了肝癌细胞生长，而过表达NCLX诱导的线粒体钙水平下降抑制了肝癌细胞生长。本研究首次证明了NCLX表达水平与肝癌的发生发展密切相关，为后续开发针对NCLX的肝癌靶向治疗药物提供了基础。