浅析乳制品中芽孢菌的检测

◎ 韩秋红，李 琴，李凯锋

（1.农业部乳品质量监督检验测试中心（哈尔滨），黑龙江 哈尔滨 150090；2.黑龙江省完达山乳业股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150087）

牛奶的组成接近于人体母乳，因此人体很容易消化和吸收牛奶的营养成分。牛奶的营养成分主要包括水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素等[1]。牛奶良好的营养也适宜微生物生长。据报道，芽孢杆菌属在原料乳中污染最严重。芽孢是某些细菌在生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体[2]。农场中的饲料、土壤和粪便等易受芽孢菌污染，牛舍周围也广泛存在芽孢菌[3]，这些菌易污染奶牛乳头表面，使原料乳污染芽孢菌。当原料奶中有较多的芽孢时，加工后贮存过程中芽孢转化为营养体，随着贮存期的延长会出现酸包、胀包现象[4]。作为乳与乳制品中的风险监测项目，芽孢菌检测十分重要。目前国内检测乳与乳制品中芽孢菌的权威方法为农业行业标准NY/T 1331-2007中第二部分需氧芽孢总数测定方法，本文对该检测方法进行解读并重点分析检测的注意事项。

1 检测原理

利用微生物能够生长和繁殖的特性，使微生物由肉眼看不见的微小个体变为肉眼可见的菌落。

将样品加热处理以除去非芽孢菌，然后向样液中加入能为芽孢菌提供丰富营养的乳平板计数琼脂培养基（MPC培养基），放入合适环境下培养，最后计数。

2 稀释液和培养基的作用与使用要求

（1）蛋白胨-盐溶液各组分作用。酶水解酪蛋白胨既为芽孢菌提供氮源，又为其提供生长因子；氯化钠能平衡芽孢菌的渗透压。

（2）磷酸盐缓冲液的作用。磷酸盐缓冲液调节盐平衡，还可缓冲调整液体pH。

（3）MPC培养基各组分作用。酵母浸膏可给芽孢菌提供丰富的B族维生素；胰蛋白胨既是芽孢菌中氮的来源，又是芽孢菌中碳的来源；葡萄糖是芽孢菌的能源物质；脱脂奶粉使整个培养基体系更接近乳制品，还原芽孢菌的生长环境。

（4）MPC培养基使用要求。①若灭菌后马上使用，则灭菌后将其冷却后放入45 ℃水浴中。②灭菌后需要贮存，则将其冷藏存放于暗处，存储时间应小于30 d。③若使用前加热融化培养基，则将融化好的培养基放于水浴中，水温为45 ℃。

3 设备、材料及注意事项

①微生物实验室常用设备和材料及（36±1）℃培养箱、（45±1）℃和（80±1）℃水浴锅，无菌的培养皿、吸管（或移液器及枪头）以及试管。②应注意培养皿等物品的清洁无菌状态，且不含有抑菌的任何成分。③推荐使用微量移液器及吸头，若使用吸管则不允许用嘴去吸吸管。④应注意使用的微量移液器是否可高压灭菌，是否检定或校准。⑤培养箱及计量设备应按规定做检定或校准及进行期间核查，注意利用并及时更新修正因子。

4 具体操作及注意事项

4.1 检样处理及注意事项

4.1.1 检样处理

称取固态样品10 g（或25 g），加入90 mL（或225 mL）稀释液（蛋白胨-盐溶液或磷酸盐缓冲液）中混匀，制成10-1的初级稀释液。

4.1.2 注意事项

①注意对样品外包装处理的要求，保证样品外包装进入无菌室前清洁。②注意样品混匀（“三个混匀”之一），如混匀液体样品可将其翻转25次，避免形成泡沫。③注意称样要准确。④注意溶解固体样品的稀释液应预热至45 ℃。⑤注意样品与稀释液要混匀（“三个混匀”之二）。若手动振摇稀释液，应保证液体在7 s内以30 cm振幅进行25次往返振摇。

4.2 加热处理及注意事项

4.2.1 加热处理

准备好（80±1）℃水浴，将5～10 mL液体样品，或5～10 mL固态样品初级稀释液，放入灭菌后的试管中。把试管立刻放入水浴加热10 min，取出立刻冷却于低于20 ℃的流水中。

4.2.2 注意事项

①向试管中加样液不得碰触超出水浴水面的试管内壁，也不得碰触水面以下2 cm以内的试管内壁。②吸样量要准确。③吸液时，不同规格的吸头浸入液面的合适深度不同。使用规格为200 μL～2 mL的吸头浸入液面深度应为3～6 mm；使用规格为大于2 mL的吸头浸入液面深度应为6～10 mm，吸液后吸头要停留在液面下1 s。控制匀速吸液以防止带入气雾污染样品、液体冲入移液器套柄损伤密封圈和活塞以及吸液过程形成气泡。④水浴中的水面应比试管内样液面至少高出4 cm。⑤每次检测准备一个对照管，向对照管中吸入奶样后放一支温度计，以测定奶温。⑥试管内样液应在5 min内完成升温。

4.3 进一步稀释液的制备及注意事项

取1 mL热处理冷却后的样液，加入装有9 mL稀释液的试管中摇匀，得到10倍稀释样液。如此再做稀释，每次递增10倍。

注意事项：①吸取每一稀释度样液，应使用单独的吸管或吸头。②应保证稀释液灭菌后的准确体积。③将样液转入稀释液试管时，吸管或吸头顶端不可碰触稀释液面。

4.4 接种和培养及注意事项

4.4.1 接种和培养

样液培养后计数有10～150个菌落认为是选择了合适的稀释度。做递增10倍稀释的同时，取该合适稀释度液体两个1 mL加入两个培养皿内。立刻向培养皿中倾倒MPC琼脂12～15 mL混匀。同时做空白试验（加入1 mL稀释液和培养基于培养皿中混匀）。培养基凝固后倒置，于（36±1）℃堆叠培养皿培养（48±2）h。

4.4.2 注意事项

①可依据经验或产品标准限量值选择合适的稀释度。②倾倒培养基时保证所用的培养基温度约45 ℃。温度过高，会在平板盖上聚集水蒸气，如不及时翻转平板，凝结的水蒸气落入琼脂，造成菌落游走或扩散（有可能长成整个平板是一个大片菌），使计数困难，甚至菌与菌相互污染。培养基温度过低会变为固体或半固体状态，影响培养基与样品均匀混合。③加入样液后及时向培养皿中倾注培养基。倾注培养基后不要急于封盖。④样液与培养基要混匀（“三个混匀”之三）。应关注培养基与样液的混匀程度，混合时平板可按前后左右、顺时针、逆时针等方向分别晃动，直至没有明显的白色底及白色云状物。⑤倾倒培养基于培养皿并混合均匀后应水平放置待其凝固。⑥培养基凝固后立即倒置平板。⑦限制操作时间。应在15 min内完成从热处理结束到倾注培养基混匀的操作。⑧可用空培养皿加入培养基作对照试验，以检查操作过程中的无菌性。空白和对照试验培养后应均无菌落生长。⑨为防止菌落蔓延可在培养基凝固后再次加入一薄层培养基，或培养皿上盖里放一张有少许甘油的滤纸。⑩培养时间的一致性，培养温度的均匀性，培养箱放置位置要使其外壁避开阳光直射；培养箱内物品避免填充过满，保证培养箱内空气流通，培养皿与培养箱内壁距离≥25 mm，培养皿叠放在培养箱内每叠≤6个，各叠培养皿间距离≥25 mm。

4.5 菌落计数及注意事项

4.5.1 菌落计数

肉眼对培养皿计数菌落数，必要时可借助放大镜。蔓延的菌落计做一个菌落，若菌落蔓延部分大于培养皿底部的1/4则不应计数，若菌落蔓延部分比培养皿底部的1/4小，则计数培养皿中无蔓延菌落部分后，按比例计算出整个培养皿的相对结果。

4.5.2 注意事项

①计数时不要将极微小的菌落遗漏。②应识别出多个混合的菌落。③应识别培养皿上的气泡和样品等的杂质。④当培养皿上出现菌落间呈链状生长，且没有明显界线，应将一条单链作为一个菌落。⑤蔓延的菌落可能是爬行或菌落链、琼脂表面水膜和皿底水膜。

5 计算结果及注意事项

保留的培养皿应含有10～150个菌落，计算后保留两位有效数字。样品中需氧芽孢总数[CFU/mL（g）]＝保留培养皿中菌落计数总和÷（保留的第一个稀释度的培养皿个数+0.1×保留的第二个稀释度的培养皿个数）×保留的第一个稀释度的稀释倍数。

注意事项：①计算结果以整数计，修约原则为“四舍五入”法。结果既可以用10的指数报告，也可以取前两位有效数字后，用0来补位。②若每个稀释度培养皿中菌落数均为＜10，则以“＜10×最低稀释度的稀释倍数CFU/mL（g）”计。③若每个稀释度培养皿中都有150个以上菌落数，则以“＞150×最高稀释度的稀释倍数CFU/mL（g）”计。④注意培养皿菌落计数结果偏差。本人重复计数结果偏差应≤8%，双人计数结果偏差应≤10%。常见的不符合原因有：视力疲劳、注意力不集中、未充分辨认菌落，可通过避免长时间连续进行菌落计数、养成专心习惯、借助放大镜或菌落计数器进行计数等方法，使菌落计数更加准确。

6 检毕物品的废弃注意事项

①计数后的平皿应使用高压灭菌容器将其灭菌处理后，才能洗刷。②报告检测结果后，才能处理检样。

7 总结

芽孢菌检测的每一步操作过程都要密切注意无菌操作。①应注意检测中使用的培养皿等物品的清洁无菌状态，且不含有抑菌的任何成分。②注意培养基配制中其成分的有效性。③注意使用的微量移液器是否可高压灭菌，是否检定或校准。④注意样品要混匀、样品与稀释液要混匀、样液与培养基要混匀。⑤应在15 min内完成从热处理结束到倾注培养基混匀的操作。正确规范地对芽孢菌进行检测，可以对乳制品质量准确评估，为我国乳与乳产品的健康保驾护航。