超声辅助表面活性剂提取咖啡生豆中绿原酸

◎ 唐 薇，孙飞龙，曹卓松，杨 柳，宁景叶

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西 西安 710048）

绿原酸是绿咖啡豆（又常称生咖啡豆）的主要生物活性成分之一，是由咖啡酸与奎尼酸合成的一种苯丙素类物质，易溶于水、醇和丙酮等溶剂[1]，具有抗氧化性、抗菌等生物活性，应用于食品、药品和日化等多个领域[2-3]。目前，从杜仲和金银花中提取绿原酸常采用水或醇来浸提，耗材、耗时且提取率偏低，且利用表面活性剂提取绿原酸的研究甚少，所以本文利用表面活性剂聚乙二醇（PEG）用量少、增溶等性质，相比传统乙醇或者甲醇等较绿色，借助超声波技术的空化和机械搅动作用进行提取[4-5]。本文利用超声波提取法，从5种不同性质溶剂中对比优选出最佳提取剂及其浓度，并通过固液比、提取温度、提取时间进行单因素和响应面BBD法优选提取最佳工艺，本课题对咖啡生豆中绿原酸的开发利用具有一定的研究价值和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

云南A级卡蒂姆咖啡生豆，绿原酸标准品，SK5200LH超声波清洗仪，722型可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺流程

咖啡生豆烘干、粉碎、过筛→咖啡粉→PEG400超声提取→粗提液。

1.2.2 绿原酸标准曲线的制作

称取5 mg绿原酸标准品溶解于1 mL的95%乙醇中，再用95%乙醇定容至100 mL，配成0.05 mg/mL工作液备用。吸取1、2、3、4 mL和5 mL工作液用95%乙醇定容至10 mL，用95%乙醇做对照，于328 nm处测吸光度。实验重复3次，以绿原酸浓度为横坐标，平均吸光度值为纵坐标，得到一元线性回归方程y＝0.036 5x-0.006，R2＝0.999 8．其中，x为绿原酸标准溶液质量浓度（μg/mL）；y为绿原酸标准溶液吸光值。

1.2.3 提取液中绿原酸含量的测定

从待测液中移取1 mL用95%乙醇稀释后定容至10 mL，于328 nm处测吸光度，按式（1）计算绿原酸得率Y。

式（1）中，c为由标准曲线得出的绿原酸浓度，μg/mL；n为稀释倍数；v为配成溶液的体积，mL；m为咖啡粉的质量，g。

1.2.4 提取剂及其浓度的优选

精密称取1 g咖啡粉末于茄形瓶中，分别以20%、40%、60%、80% 4个不同浓度的甲醇、乙醇、PEG200、PEG400、PEG600为提取剂，在超声波清洗仪中以液固比（mL/g）30∶1，温度65 ℃，时间50 min条件下超声提取，测抽滤后滤液的吸光度，平行实验3组，计算绿原酸平均得率。

1.2.5 单因素实验

按一定液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1）与40% PEG400混匀，在不同提取温度下（50、55、60、65、70 ℃和75 ℃）超声提取一定时间（20、30、40、50、60 min和70 min），静置冷却后抽滤，于328 nm处测滤液吸光度，计算绿原酸得率，分析不同因素的影响。

1.2.6 响应面实验

根据单因素实验对液固比、提取温度、提取时间进行3因素3水平响应面分析，根据Box-Behnken Design（BBD）设计响应面实验，见表1。分析绿原酸在不同提取条件下的含量，从而优化最佳提取条件。

表1 中心组合Box-Behnken因素水平表

1.2.7 实验验证

按照Design-Expert软件中的Box-Behnken Design（BBD）模型优化后所得的提取条件,做3组平行实验，并计算得率。

2 结果与分析

2.1 提取剂及其浓度的选择

由图1可得，5种提取剂相比PEG400提取率最大，随着浓度增大，提取率先增大后减小，可能是由于黏度增大，极性减弱，不利于提取传质和溶质溶出。PEG400浓度为40%时最高，因此选40%的PEG400为最佳提取浓度和提取剂。

图1 不同提取剂对绿原酸得率的影响图

2.2 单因素实验

由单因素实验得下图2，65 ℃条件下，提取50 min，随着液固比增大得率增大到30:1时最大，之后缓慢下降，这可能由于绿原酸大部分已溶出，再增加溶剂，其他物质竞争增容位置，导致得率下降，因此液固比选择30∶1较为合适；液固比30∶1，65 ℃条件下，时间越久，得率先缓慢增加，在50 min时得率最大，之后迅速下降，原因可能是时间越久，超声波剪切作用更透彻，破坏了绿原酸分子结构，也或者其他溶质物质析出，影响了绿原酸吸光度的测定，因此提取50 min时得率最大；液固比30∶1条件下，提取50 min，期间，可能由于温度较高破坏了绿原酸的结构造成得率先升后降，因此60 ℃提取得率最大。

2.3 响应面实验

2.3.1 数学模型的建立

根据Design-Expert8.0.6设计3因素3水平实验得到二次回归方程：Y=13.45-1.13A-0.083B-0.029C+0.14AB-0.17AC+0.41BC-1.33A2-0.71B2-0.45C2，

R2=0.9882，RAdj2=0.9371，CV=1.59%＜5%，说明模型拟合度和稳定性好。方差分析见表2。

表2 回归方程方差分析表

从表2得，模型P值＜0.000 1，则实验所选的二次多项式模型在95%水平上有高度显著性；失拟值P为0.800 8＞0.05，表示在95%水平上失拟不显著，残差由随机误差引起，即模型准确可靠，方程拟合良好。表中A、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，因此，固液比的一次项，温度和时间的交互项，固液比、时间和温度的二次项对咖啡生豆中绿原酸的提取在统计学上有显著性大的影响。在所选因素水平范围内，影响绿原酸得率的因素顺序是A＞B＞C。

2.3.2 响应面3D Surface

响应面3D Surface直观反应各因素交互作用对绿原酸得率的影响，曲面坡度越大，等高线越呈现椭圆形且越密，说明交互作用影响越大，由图2可知，液固比对得率影响最大，温度和时间次之，所选时间影响最小，这与方差分析结果相吻合。

图2 各因素交互作用对绿原酸得率的影响图

2.3.3 验证试验

根据二次多项式解得最佳工艺条件（修正后）：液固比28∶1，温度60 ℃，时间50 min，咖啡生豆中绿原酸的得率是13.698 6 mg/g。平行3组实验得到平均得率为13.68 mg/g，这与模型给出的预测值基本一致。

3 讨论与结论

本实验目的在于采用绿色途径高效优化提取咖啡生豆中绿原酸的提取工艺，绿原酸广泛应用于食品和医药中，因此绿色提取工艺尤为重要。本文将常用提取剂甲醇、乙醇和不同分子量的表面活性剂PEG进行对比同时优选了提取剂的浓度，比较绿原酸的得率，通过单因素和响应面相结合，得到超声波辅助提取绿咖啡豆中绿原酸最佳工艺条件：40% PEG400为提取剂，液固比28∶1，温度60 ℃，时间50 min，得到得率为13.68 mg/g，由响应面分析得影响得率的因素顺序：液固比＞温度＞时间。该提取工艺操作简单，能耗少，得率高，为提取绿原酸提供一定参考价值。