哺乳动物早期胚胎滋养外胚层发育的研究进展

张艳艳，彭 辉，肖天放

(福建农林大学动物科学学院，福州 350002)

滋养外胚层的形成对早期胚胎的发育至关重要。滋养外胚层完整性受损将导致囊胚形成失败甚至死亡，同时滋养外胚层的渗透性和液体转运功能受阻也将导致囊胚形成失败；滋养外胚层不能正确地分化将造成胚胎不能附植或附植后形成的胎盘畸形，进而增加胎儿的流产率和死亡率，因此，研究调控滋养外胚层完整性和功能的分子机制具有重要的理论和实践意义。

1 哺乳动物滋养外胚层的发育

哺乳动物早期胚胎发育到一定时期发生胚胎致密化，致密化是以相邻卵裂球界限不清、细胞变扁和E-cadherin依赖细胞间黏附的确立为特征的形态变化过程。卵裂球获得以微绒毛顶端定位为特征的细胞极性和获得胞质极性，之后随着细胞分裂，外部细胞保持极性并产生滋养外胚层上皮。在囊胚形成的过程中，滋养外胚层细胞形成有黏附连接和紧密连接功能的转运上皮[1]。钠泵(Na+/K+-ATPase)的活性导致穿过滋养外胚层离子梯度的确立和囊胚腔形成过程中的液体积聚[2]。此外，水通道有助于穿过滋养外胚层的水运动并导致囊胚腔扩张[3]。囊胚从透明带中孵出以后，滋养外胚层又分化为2种滋养层细胞：覆盖内细胞团的细胞，称极滋养层(polar trophoblast)；围绕囊胚腔的细胞，称壁滋养层(mural trophoblast)。极滋养层增殖活跃，刺激极滋养层增殖的信号起源于内细胞团，并且在局部起作用[4]。壁滋养层细胞围绕囊胚腔，不能与内细胞团紧密连接。附植以后，覆盖在内细胞团外面的极滋养层细胞继续增殖，形成包含滋养层干细胞的胚外外胚层(extra-embryonic ectoderm, ExE)和二倍体的绒毛膜锥(ectoplacental cone, EPC)，同时壁滋养层细胞停止分裂形成滋养层巨细胞[5]。

2 哺乳动物滋养外胚层发育需要的关键基因及其相互关系

2.1 哺乳动物滋养外胚层发育需要的关键基因

在附植前胚胎发育过程中，调节滋养外胚层发育的基因主要有含TEA结构域的家族成员4 (TEA domain family member 4,Tead4)、尾型同源盒转录因子2 (caudal type homeobox 2,Cdx2)和Eomes(eomesodermin)，且这3个基因都是滋养外胚层发育所必需的[6-8]。Cdx2在滋养外胚层和内细胞团谱系分化中起作用，Eomes参与极滋养层和壁滋养层细胞命运的控制，Ets家族成员E74样转录因子5 (E74-like factor 5,Elf5)在极滋养层细胞谱系分化过程中，参与控制胚外外胚层和绒毛膜锥的细胞决定[9]。此外，SRY盒转录因子2 (SRY-box 2,Sox2)和叉头框转录因子D3 (forkhead box D3,Foxd3)对滋养层和外胚层的发育也非常重要[10]，母源性的Sox 2调控滋养层的分化命运[11]，而敲除Foxd3将影响早期胚胎外胚层的形成[12]。

在小鼠未受精卵母细胞和受精合子中几乎检测不到Tead4 mRNA，但从2-细胞期开始，Tead4表达增加一直贯穿整个胚泡期，在8-细胞和桑椹胚期Tead4的表达达到峰值[6]，此时，正是滋养外胚层形成和分化的关键时期。Tead4在滋养层干细胞中表达极显著高于在胚胎干细胞中表达，而在滋养层干细胞分化成滋养层巨细胞的过程中，这种高水平表达一直维持着。然而，Tead4在胚胎干细胞分化成胚状体的过程中一直低水平表达，说明Tead4主要在滋养外胚层中起作用[6]。敲除Tead4基因后，Tead4-/-胚胎桑椹胚以前的发育与Tead4+/+和Tead4+/-胚胎没有差异，之后，Tead4-/-胚胎不能形成囊胚腔，维持着桑椹胚样的形态[13]。细胞数量与Tead4+/+和Tead4+/-胚胎的细胞数量没有显著差异[13]，说明尽管Tead4-/-胚胎的细胞增殖没有阻断或延迟，但却不能形成滋养外胚层。在Tead4-/-胚胎中所有测定的滋养外胚层特异基因Cdx2、整联蛋白α 7 (integrin alpha 7，Itga7)和钙黏蛋白3 (cadherin 3，Cdh3)均没有表达，而Eomes和成纤维细胞生长因子受体2 (fibroblast growth factor receptor 2，Fgfr2)的表达显著降低，表明，滋养外胚层发育失败[13]，从而说明了滋养外胚层的发育离不开Tead4的表达[14]。

Cdx2在滋养外胚层中的表达是所知道的谱系分化的早期事件之一[15]，免疫荧光定位分析表明，Cdx2从8-细胞开始表达，从8-～32-细胞，Cdx2的表达水平明显增加[16]。在囊胚阶段早期，Cdx2的表达更多的限制在胚胎外部细胞；在扩张囊胚阶段，Cdx 2蛋白只定位在滋养外胚层的细胞核。敲除Cdx2基因后，Cdx2-/-胚胎能够形成囊胚腔，但囊胚腔却不能维持，并伴随着滋养外胚层细胞形态学上的改变，而Cdx2+/+和Cdx2+/-胚胎能够形成扩张囊胚，并从透明带中孵出[7]，说明敲除Cdx2基因后滋养外胚层的发育不完全或发育失败。分析滋养层特异的标志基因表明，Cdx2-/-胚胎能够表达滋养外胚层标志基因Eomes和Fgfr2，但Eomes的表达显著降低，分化的滋养层巨细胞标志基因Hand1和Pl1的表达在Cdx2-/-胚胎中检测不到，而它们在Cdx2+/+和Cdx2+/-胚胎中能够检测到[7]。进一步的研究表明，Cdx2-/-胚胎在体外不能形成滋养层巨细胞或滋养层干细胞，说明胚胎早期滋养外胚层的发育需要Cdx2表达。

Eomes转录物首次在囊胚滋养层细胞中被检测到，之后在胚外外胚层持续表达[8]。小鼠早期胚胎缺乏Eomes，将导致胚胎阻滞在囊胚期，究其原因发现，突变的滋养外胚层不能分化为滋养层，也不能进一步分化为极滋养层和壁滋养层细胞[8]。因此，滋养外胚层的发育需要Eomes参与。

2.2 哺乳动物滋养外胚层特异性基因Tead 4、Cdx 2和Eomes之间的关系

在鼠胚早期发育过程中，Tead4首先在2-细胞开始表达，在8-细胞和桑椹胚Tead4的表达达到峰值。在Tead4-/-胚胎中Cdx2的表达剧烈下调，表明Tead4在Cdx2上游调节滋养外胚层的发育[13]。因为在8-～18-细胞Cdx2微弱表达，同时Cdx2表达的维持或上调需要Tead4。然而，在Tead4-/-胚胎中，Eomes不表达或微弱表达[6,13]，出现这种情况的原因可能为检测的方法不同而导致检测的灵敏度不同，总之，Eomes高水平表达需要Tead4 的存在，说明Tead4在Eomes的上游起调节作用。Cdx2从8-细胞开始表达，从8-～32-细胞，Cdx2的表达水平明显增加。在Cdx2-/-胚胎中Eomes表达显著降低和在胚胎干细胞中通过Cdx2能够快速诱导Eomes表达，说明Eomes在Cdx2下游区，但在Cdx2-/-胚胎中，Eomes持续表达也表明，存在Eomes表达不依赖Cdx2机制[7]。在Tead4-/-胚胎中Eomes不表达，暗示Tead4调节Eomes不依赖Cdx2。Tead4-/-胚胎不能形成囊胚，Cdx2-/-胚胎能够形成暂时的囊胚，之后囊胚腔很快塌陷，而Eomes-/-胚胎能够形成扩张囊胚，表明在Eomes-/-胚胎中，Tead4和Cdx2能够正常表达。

Tead4、Cdx2和Eomes可能通过3种不同的途径调节滋养外胚层的发育和囊胚腔形成。第1种是Cdx2依赖途径，Tead4在外部细胞中激活Cdx2，Cdx2促进滋养外胚层的发育。第2种是Eomes依赖途径，Tead4激活Eomes的表达，Eomes再调节滋养外胚层的发育。同时，Cdx2也能激活Eomes。第3种是Tead4依赖途径，Tead 4不依赖Cdx2和Eomes而直接调节滋养外胚层特异基因的表达。总之，Tead4、Cdx2和Eomes相互协作促进滋养外胚层的发育。

3 调控哺乳动物滋养外胚层完整性和功能相关的蛋白

滋养外胚层的完整性和功能维持对附植前胚胎发育至关重要。滋养外胚层的完整性和功能受到损坏将导致胚胎发育停止、不能形成囊胚腔或胚胎致死。影响滋养外胚层完整性和功能蛋白主要有粘附连接蛋白、紧密连接蛋白、Na+/K+-ATPase和水通道蛋白等。

在胚胎致密化过程中，粘附连接蛋白E-cadherin与catenin形成粘附复合体，一方面，有利于外部卵裂球的极化，另一方面，有利于紧密连接的形成和滋养外胚层的分化。Catenin包括α-catenin、β-catenin和γ-catenin。研究表明，β-catenin敲除胚胎和γ-catenin敲除胚胎能够发育到囊胚阶段[17-18]，说明滋养外胚层的发育正常，其完整性和功能能够继续维持。然而，E-cad-/-胚胎不能形成滋养外胚层上皮和囊胚腔[19]，而α-catenin敲除胚胎的滋养外胚层上皮也是异常的[20]，表明在滋养外胚层的发育中E-cadherin和α-catenin起着非常重要的作用。

在囊胚的形成过程中，滋养外胚层细胞间由紧密连接形成所产生的渗透性封闭十分重要，是囊胚形成的必要条件。如果紧密连接封闭不充分，转运的物质很可能通过细胞间的缝隙而渗漏，致使不能形成扩张囊胚。研究表明，在胚胎的早期发育过程中完全敲除或沉默ZO-2[21]、ZO-3[22]、Cingulin[23]和Occludin[24]并不影响紧密连接的形成，而使ZO-1 沉默将导致胚胎不能发育到囊胚[25]。敲除组织中特异表达的Claudin基因显示紧密连接的形成和屏障功能被破坏[26-28]，说明紧密连接的形成需要ZO-1和Claudin蛋白的表达与正确组装。

在囊胚形成之前，Na+/K+-ATPase极化分布在滋养外胚层基底外侧膜[29]。在桑椹胚～囊胚的形成过程中，Na+/K+-ATPase亚基基因表达上调，且Na+/K+-ATPase的活性显著增加，用Na+/K+-ATPase的特异性抑制剂Ouabain处理之后影响囊胚形成[30]，说明Na+/K+-ATPase在囊胚的形成过程中发挥作用。此外，Na+/K+-ATPase β亚基本身具有细胞间黏附分子的功能[31]，在早期胚胎的发育过程中，紧密连接的组装需要Na+/K+-ATPase的活性[32]，因此，Na+/K+-ATPase还能够调节滋养外胚层细胞间紧密连接的形成和功能[30]。

在囊胚形成过程中，水通道蛋白(AQPs)在促进水运动方面可能起着重要的作用[33]。目前，在哺乳动物上已经鉴别出11个水通道蛋白，根据该家族蛋白对水和小分子的选择性通透作用，该家族蛋白又可分为2个亚群。AQP 0、AQP 1、AQP 2、AQP 4、AQP 5、AQP 6、AQP 8和AQP 10对水分子具有高度选择性，而AQP 3、AQP 7和AQP 9的选择性相对较差，允许小分子通过[34]。

Na+/K+-ATPase和AQPs介导的穿过滋养外胚层的水运动，加上紧密连接封闭以阻断水的渗漏是促进囊胚形成的主要机制。由此可知，在胚胎的早期发育过程中，粘附连接蛋白、紧密连接蛋白、Na+/K+-ATPase和水通道蛋白对滋养外胚层的发育和囊胚形成起着至关重要的作用。

4 维持滋养外胚层完整性和功能的蛋白与Tead 4和Cdx 2之间的关系

由上述可知，在胚胎的早期发育过程中，粘附连接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、紧密连接蛋白(ZO-1)、Na+/K+-ATPase和AQPs在滋养外胚层的发育和囊胚形成方面起重要作用。E-cad-/-胚胎和α-cat-/-胚胎发育异常，ZO-1和Na+/K+-ATPase β1亚型沉默都将导致胚胎不能发育到囊胚，而Tead4-/-胚胎和Cdx2-/-胚胎的滋养外胚层谱系发育失败，胚胎不能形成囊胚腔或形成的囊胚腔不能维持，因此推测，粘附连接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、紧密连接蛋白(ZO-1)、Na+/K+-ATPase和AQPs与Tead4及Cdx2之间可能存在某种关系。E-cadherin、α-catenin、ZO-1 α-、Na+/K+-ATPase和关键的AQPs在胚胎附植前发育的所有阶段都表达，Tead4和Cdx2可能直接或间接调控E-cadherin、α-catenin和ZO-1 α在粘附连接复合体和紧密连接上的组装、Na+/K+-ATPase在滋养外胚层膜区的定位或插入到膜区以及关键AQPs的表达与功能。ZO-1 α和Na+/K+-ATPase β1亚型在桑椹胚～囊胚的转换过程中表达，推测Tead4和Cdx2很可能直接或间接调控ZO-1和Na+/K+-ATPase β1基因表达。

5 展 望

利用基因敲除方法分别制作Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎，对滋养外胚层特异基因的表达以及滋养外胚层的分化机理进行研究。Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎不能形成囊胚腔或形成的囊胚腔不能维持，暗示滋养外胚层的完整性和功能受到损坏。对粘附连接成分E-cadherin和β-catenin以及紧密连接成分ZO-1的定位进行研究，同时研究细胞极化成分、JNK底物蛋白c-Jun以及p38 MAPK信号，结果只有E-cadherin和ZO-1的定位有些异常，其它的均正常[13,15]，说明Tead4或Cdx2与滋养外胚层连接的形成有一定关系，但二者之间有什么因果关系仍不清楚。Tead4或Cdx2应该还存在调控滋养外胚层完整性和功能的其它机制[35-36]。Na+/K+-ATPase和AQPs在囊胚的形成过程中起着重要作用，Tead4-/-和Cdx2-/-胚胎的囊胚腔形成失败可能与Na+/K+-ATPase和AQPs相关的机制没有进行深入研究。通过RNA干扰与基因敲除技术建立Tead4或Cdx2沉默与敲除的胚胎，Tead4和Cdx2的表达与粘附连接蛋白(E-cadherin和α-catenin)、紧密连接蛋白(ZO-1α-和ZO-1 α+)、Na+/K+-ATPase和关键AQPs的表达与定位之间的关系，阐明Tead4和Cdx2维持滋养外胚层完整性和功能的分子机制有待进一步研究和证实。