牛冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

何琪富，郭紫晶，李 然，周 军，岳 华，2，张 斌，2，汤 承，2*

(1. 西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041； 2.国家民委青藏高原动物疫病防控创新团队，成都 610041)

牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)可以引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病，该病毒在世界范围内流行，给养牛业造成了巨大的经济损失[1]。BCoV属于冠状病毒科，冠状病毒属2a亚群，其基因组是RNA病毒中最大的，长度为27～32 kb ，主要包括2个开放阅读框(ORF1a和ORF1b)和5个结构蛋白：血凝素酯酶蛋白(HE)、纤毛蛋白(S)、小膜蛋白(E)、跨膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。编码核衣壳蛋白的N基因高度保守，常作为BCoV的分子检测的靶基因[2]。

RT-PCR方法是病原检测和流行病学调查的主要方法，目前国内外已建立了多种检测BCoV RT-PCR方法，靶基因多为N基因[2-9]，也有选择编码跨膜蛋白的M基因[10]。最近作者实验室采用国外BCoV诊断和流行病学调查常用的RT-PCR方法[2]，以及国内常用的RT-PCR方法[3]复核宏病毒组技术证实为BCoV阳性的牛腹泻粪便样本时，结果两种方法均未能检出BCoV，其原因有待于进一步研究。本试验的目的是建立灵敏度更高的BCoV RT-PCR检测方法，应用该方法对川西北草原牦牛腹泻粪便样本和患呼吸道疾病综合征的牦牛鼻腔棉拭子进行BCoV的检测。

1 材料与方法

1.1 病毒(菌)株、临床样本

BCoV阳性株，用于特异性验证的病毒(菌)株及核酸样本：牛轮状病毒(bovine rotavirus virus，BRV)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)Swun0603、牛星状病毒(bovine astrovirus，BAstV)Swun0201、牛肠炎病毒(bovine enterovirus，BEV)Swun0510、牛细小病毒(bovine parvovirus，BPV)、牛kobu病毒(bovine Kobu virus，BKV)、牛源K99大肠杆菌Swun4025、牛源都柏林沙门菌Swun3736、牛源产气荚膜梭菌Swun2930、牛源空肠弯曲杆菌Swun1639、牛源艾美尔球虫、牛源安氏隐孢子虫的核酸样本由本实验室保存。

用于检测方法比较的样本：56份3～6月龄肉牛腹泻粪便样本(2017年采自四川省4个养殖场)、57份3～6月龄肉牛有明显呼吸道疾病症状的鼻拭子(2017年采自四川省4个养殖场)、20份3月龄以内牦牛腹泻粪便样本(2015年采自四川省红原县)、20份3月龄以内牦牛有明显呼吸道疾病症状的鼻拭子(2015年采自四川省红原县)。

用于流行病学调查的样本：125份3月龄以内牦牛腹泻粪便样本(2016年6～8月采自四川省阿坝藏羌自治州红原县、若尔盖县、阿坝县的8个牧场)、98份6月龄以内有咳嗽、流鼻涕等明显呼吸道疾病症状牦牛的深部鼻腔拭子样本(2016年7～10月 采自四川省阿坝藏羌自治州红原县、若尔盖县、阿坝县的7个牧场)。所有样本于-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂及仪器

TrizolTMReagent、PrimeScriptTM、PMD19-T克隆载体等购于TaKaRa公司；DNA Marker、DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒购于宝生物工程(大连)股份有限公司；AXY prepTMDNA胶回收试剂盒购于Axygen公司；紫外分光光度计Cary50Probe(Vatian公司，美国)；凝胶成像系统Doc2000(Bio-Rad公司，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)。

1.3 检测引物的设计与合成

在对GenBank收录的全部19条BCoV全基因组序列及本实验室宏病毒组数据(GenBank accession number：srp 108885)生物信息学分析的基础上，选择比N基因更为保守的聚合酶基因Nsp7-Nsp9片段设计特异性检测引物，引物序列：F:5′-CGAGTTGAACACCCAGAT-3′ R:5′-GAGACGG-GCATCTACACT-3′，见表1，扩增长度为230 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 核酸提取

将临床粪便样本及呼吸道样本与PBS(1∶5)充分重悬混匀，-80 ℃冰箱中反复冻融3次，3 000 r·min-1离心10 min，弃沉淀，再以12 000 r·min-1离心30 min，取上清，然后按照Trizol Reagent说明书提取总RNA，并按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，-20 ℃保存备用；DNA提取采用酚-氯仿法，-20 ℃保存备用。

1.5 阳性质粒的制备

以BCoV阳性cDNA为模板，加入本试验设计检测引物进行PCR反应，PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收目的片段，并将其克隆至pMD19-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养8 h，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，送生工生物有限公司测序。

1.6 反应体系及条件的优化

采用25 μL体系(预混酶12.5 μL，BCoV阳性标准品1.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O补足至25 μL)，对退火温度从45～55 ℃进行优化，再以优化的退火温度对浓度为10 μmol·μL-1的引物用量(0.5～1.5 μL)进行优化。

1.7 特异性评价

用本实验建立的RT-PCR方法对“1.1”中待检病原的核酸样本进行检测，并设立标准阳性样本和阴性对照，以评价该方法的特异性。

1.8 重复性评价

用本试验建立的RT-PCR方法对3个阳性模板及3份阴性样本进行3次重复检测，以评价方法的重复性。

1.9 敏感性测定

将牛CoV阳性标准品10倍递增稀释后作为模板(1×100、1×10-1～1×10-6)，对本试验建立的RT-PCR方法进行检测，确定检测下限。

1.10 三种RT-PCR方法的比较

1.10.1 三种方法对临床样本中BCoV检出率的比较 采用所建立的RT-PCR方法和文献[2]、[3]报道的检测BCoV的RT-PCR方法同时对56份肉牛、20份牦牛腹泻粪便样本、57份肉牛及20份牦牛呼吸道鼻腔拭子进行检测，比较这3种方法的检出率，引物信息见表1，三种方法检测为阳性的PCR产物全部送公司测序。

表1RT-PCR方法的引物信息表

Table1PrimersinformationforthreekindsofRT-PCRassay

检测方法Test method靶基因Target gene引物序列Primer sequence引物来源Source of primers1聚合酶基因F:5'-CGAGTTGAACACCCAGAT-3'本研究R:5'-GAGACGGGCATCTACACT-3'2NF:5'-GCAATCCAGTAGTAGAGCGT-3'[2]R:5'-CTTAGTGGCATCCTTGCCAA-3'3NF:5'-GAGCGTCCTTTGGAAATCGT-3'[3]R:5'-GCTTAGTTACTTGCTGTGGC-3'

1.10.2 三种方法的灵敏度比较 利用文献[2]和文献[3]中检测引物进行PCR反应，产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收目的片段，并将其克隆至pMD19-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养8 h，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，送生工生物有限公司测序。将阳性质粒10倍递增稀释后作为模板(1×100、1×10-1～1×10-6)，比较三种RT-PCR检测方法的检测下限。

1.11 临床样本中BCoV的检测

采用本试验建立的RT-PCR方法对2016年采自川西北草原的125份牦牛腹泻粪便样本以及98份 有咳嗽、流鼻涕等明显呼吸道疾病症状牦牛的深部鼻腔拭子样本进行BCoV的检测，分析牦牛CoV在川西北草原的流行情况。

2 结 果

2.1 优化的RT-PCR反应体系及条件

优化的RT-PCR反应体系及条件：预混酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·μL-1)各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O补足25 μL。反应条件：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s；49 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；16 ℃ 反应结束。

2.2 方法的特异性

该方法能从BCoV阳性样本中检出目的基因片段，对BRV、BVDV、BAstV、BEV、牛细小病毒、牛Kobu病毒、牛源K99大肠杆菌、牛源都柏林沙门菌、牛源产气荚膜梭菌、牛源艾美尔球虫、牛源安氏隐孢子虫的核酸样本无扩增。

2.3 方法的重复性

用本试验设计的检测引物对同一模板3次重复检测结果一致，证明该方法有良好的重复性(结果未展示)。

2.4 方法的敏感性

对“1.5”中所制备阳性标准品质粒浓度进行测定，质量浓度为100 ng·μL-1，敏感性检测结果显示，在1×107稀释度阳性标准品仍可见目的条带，对BCoV的核酸最低检测限为1×10-2pg· μL-1,说明本试验设计方法具有较好的灵敏性。

2.5 三种检测BCoV方法的比较

2.5.1 三种检测BCoV方法对临床样本的检出率 三 种方法对临床样本中BCoV的检出率见表2，检出的全部阳性PCR产物测序结果证实均为BCoV基因片段。方法2和方法3检出BCoV阳性的数量和编号一致，且本试验建立的方法检出的阳性样本包含了方法2、3检测的全部样本。可见本试验建立的RT-PCR方法对肉牛和牦牛的BCoV检测都有良好的检测效果。

表2三种方法检出率比较

Table2ThedetectionrateofthreekindsofRT-PCRassay

检测方法Test method肉牛样本类型及结果Sample type and results of beef cattle牦牛样本类型及结果Sample type and results of yak腹泻粪便(n=56)呼吸道(n=57)腹泻粪便(n=20)呼吸道(n=20)方法来源Source of primers112.50%(7/56)12.28%(7/57)75.00%(15/20)70.00%(14/20)本研究25.36%(3/56)7.02%(4/57)15.00%(3/20)20.00%(4/20)[2]35.36%(3/56)7.02%(4/57)15.00%(3/20)20.00%(4/20)[3]

2.5.2 三种检测BCoV方法的灵敏度 利用核酸蛋白浓度分析仪测量三种阳性标准品质粒浓度均为100 g·μL-1，敏感性检测结果显示，本试验所建立的方法的灵敏度为1×10-2pg·μL-1，参考文献[2]报道方法和参考文献[3]报道方法的灵敏度分别为1×100、1×101pg·μL-1。本试验建立方法灵敏性比参考文献[2]报道的方法的灵敏性高了两个数量级，比参考文献[3]报道的方法的灵敏性高了三个数量级。

2.6 临床样本中BCoV的检测

利用本试验建立的RT-PCR检测方法对2016年6—8月份采自四川省阿坝藏羌自治州红原县、若尔盖县、阿坝县的125份犊牦牛腹泻粪便样本以及98份有呼吸道疾病综合征的牦牛鼻腔拭子进行BCoV的检测，结果如表3、表4所示。对检出的阳性样本随机挑选20%进行测序，证实检出无误，同时也进一步验证本试验建立的RT-PCR方法检测结果的准确性。

表3牦牛腹泻样本中BCoV的检出率

Table3ThedetectionrateofyakBCoVinfectionindiarrheasamples

牧场 FarmsABCDEFGH合计 Total样本数/份 Samples181930101051320125阳性样本数/份 Positive samples13132177491589阳性率/% Positive rates72.2268.4270.0070.0070.0080.0069.2375.0071.20

表4牦牛呼吸道样本中BCoV的检出率

Table4ThedetectionrateofyakBCoVinfectioninnasalcavitysamples

牧场 FarmsABCDEFG合计 Total样本数/份 Samples1515101517141298阳性样本数/份 Positive samples11107111310971阳性率/% Positive rates73.3366.6770.0073.3376.4771.4375.0072.45

3 讨 论

犊牛腹泻是临床上最常见的一类疾病，给养牛业造成了严重损失。犊牛腹泻病因复杂，其中病原微生物感染是造成牛腹泻的重要原因，引起犊牛腹泻的常见病毒有BCoV、BRV、BVDV[11-12]。并且有新的致腹泻病毒出现，如诺如病毒、Nebovirus等[13-14]，使诊断更加困难。本实验室前期用宏病毒组技术无偏差鉴定犊牛腹泻样本中病毒种类时，发现存在BCoV核酸序列(GenBank accession number：srp 108885)，但采用国外BCoV诊断和流行病学调查常用的RT-PCR方法[2]以及国内常用的RT-PCR方法[3]进行复核时，两种方法均未能检出。由于BCoV是危害养牛业重要病原之一，因此有必要建立新的RT-PCR方法，以提高对临床样本中BCoV的检出率。鉴于采用的两个以N基因为检测靶点的RT-PCR方法未能检出宏病毒组技术证实为BCoV阳性的牛腹泻粪便样本。因此，我们对GenBank中全部19条BCoV的聚合酶基因以及47条N基 因的序列进行生物信息学分析，发现N基因变异率为0.011，超过20%毒株在同一位点发生变异比例为0.014(20/1 470)；聚合酶基因Nsp7-Nsp9序列变异率为0.004，超过20%毒株在同一位点发生变异比例为0.003(10/3 193)，其变异率显著低于N基因变异率。同时，聚合酶基因在人和动物的CoV中也是常用的分子检测靶点[15-16]。因此，根据BCoV聚合酶基因Nsp7-Nsp9片段设计引物，成功建立方法，特异性和重复性好，灵敏性是目前BCoV RT-PCR检测方法中最高的[2-3]，对肉牛和牦牛都有很好的检测效果，为BCoV的检测和流行病学调查提供了有力工具。

关于牦牛BCoV的流行病学资料很少，还没有见到关于病原流行病学调查的报道。但从仅有的3篇 相关牦牛血清流行病学调查[17-19]数据表明，BCoV的血清阳性率很高。川西北草原属青藏高原东南缘，是我国五大牧区之一，也是我国主要的牦牛养殖地区之一。由于青藏高原特殊的自然地理环境，牦牛产犊主要集中在4—5月份，犊牛腹泻导致发病率和死亡率都很高，造成严重损失[20]。作者对2016年6—8月采自该地区犊牛腹泻粪便样本调查表明，BCoV场阳性率8/8，样本阳性率71.20%，表明川西北牦牛腹泻样本中BCoV检出率很高。鉴于BCoV是犊牛腹泻、成年牛冬痢的重要病原，可以确定BCoV是川西北牦牛腹泻的重要原因，为犊牛腹泻的防控提供了科学依据。

牛呼吸道疾病综合征是危害养牛业的另一大类疾病[21-22]，其中病毒感染是重要病因。常见的病毒有BPIV3、BVDV、IBRV、BCoV、BRSV等[23-27]。病毒感染后损害呼吸道黏膜的完整性引起发病，在细菌、支原体等混合/继发感染时病情加重[28-29]。呼吸道疾病综合征也是牦牛多发病，但目前未见关于牦牛呼吸道疾病综合征的病原流行病学资料。对2016年 川西北草原牦牛98份呼吸道样本进行病原学 检测，牦牛CoV 场阳性率是7/7，样本阳性率72.45%。BCoV不仅可以引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢，而且是牛呼吸道疾病综合征的重要病因[25,30]。因此，在川西北牦牛呼吸道疾病综合征中BCoV扮演着重要角色。

4 结 论

成功建立BCoV的RT-PCR检测方法，该方法特异性和重复性好，灵敏性达到1×10-2pg·μL-1，为BCoV 的检测和流行病学调查提供了新的技术手段；流行病学调查结果显示川西北草原牦牛腹泻粪便样本和表现有呼吸道疾病症状牦牛的深部鼻腔拭子中BCoV阳性率很高，证明BCoV是川西北草原牦牛腹泻和呼吸道疾病综合征的重要病原。