三维培养下应力对间充质干细胞分化的影响研究进展

张旭林，徐永清，毛羽驰,何晓清，刘 帅

作者单位：650032昆明，昆明医科大学研究生部（张旭林，毛羽驰，刘 帅）；解放军920医院骨科（张旭林，徐永清，何晓清，刘 帅）

在骨科临床实践中，伊利扎诺夫技术（Ilizarov）解决了许多令医生们头疼的疑难杂症，其治疗适应证也在基础研究的带领下不断拓宽，如糖尿病足、脑中风、脊柱侧弯等。而该技术的核心“张力-应力法则”，则进一步将应力与细胞分化联系在一起。但该技术目前最大的阻碍是长时间佩戴给患者带来的不便及引起的各种临床并发症[1]。随着伊利扎诺夫技术的推广，寻求缩短治疗时间和减少并发症的方法显得极为重要。而三维细胞培养可能是解决上述问题的有效措施的基础之一，因此，笔者对三维培养下应力对间充质干细胞分化的相关研究进行综述。

1 三维培养对应力下间充质干细胞(MSCs)分化研究的优势

MSCs是一种具有多向分化潜能，来源于中胚层和神经外胚层，并且不表达造血系相关标志的成体多能干细胞[2]。根据来源可以分为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、滑膜间充质干细胞等。目前相关文献均认为身体的各部分间充质内均含有MSCs，而且其比成体干细胞有更大的分化潜能，同时也减少了伦理审查的要求，所以，MSCs从发现之初便被寄予厚望[3-4]。但在诸如实验室普通细胞瓶等二维培养环境下，MSCs分化率低。而立体培养技术相对而言，更能模拟身体内细胞的生理环境，有利于细胞的基因表达和信号传导，更有利于模拟牵拉成骨过程中应力对MSCs分化的影响，进而研究提高牵拉成骨效率的方法。

1.1 三维培养下细胞联系密切 二维细胞培养技术是近代生物医学发展的基础，但是，以这种模式所建立的细胞模型与细胞实际所处的生长环境有差异，不能像体内一样进行信号通路和内分泌传导。而三维培养作为一种更接近于机体生理环境的细胞培养方式，它更能给细胞提供生长和信息传递所需的仿生环境。基于此特点，在肿瘤、干细胞、组织工程等领域中，三维细胞培养的应用价值更为突出。Hanahan等[5]研究表明，三维培养下更能观察到肿瘤独特的性质，包括独特的生长信号、永生性、无限复制、失控的血管增殖、组织侵袭、躲避免疫攻击、促进肿瘤的炎症等特性。所以，不断有研究者利用三维培养来论证其优势。Wang等[6]用三维培养来研究前列腺癌，证实了细胞与三维支架所形成的结构对细胞的分化和表型均有帮助；Kim等[7]通过乳腺癌细胞实验表明，三维细胞培养可以实现在同一体系中培养不同表型的肿瘤细胞，比传统细胞培养更准确地模拟肿瘤组织的结构和分化。

三维细胞培养类型根据外力施加的有无分为静止三维培养和动力三维培养，其中由于静止三维培养过程中重力是唯一的力学影响因素，而本综述涉及的是外界应力，所以，本研究只讨论动力三维培养。在胚胎发育过程中，细胞间不仅通过自分泌和旁分泌调节增殖和分化，也通过应力的变化产生联系。临床应用中Ilizarov技术就是一个很好的例子，通过缓慢牵拉组织来使某些组织获得再生。Leucht等[8]的研究表明，应力通过细胞外基质传递到细胞，而应力对细胞的刺激可以改变细胞内部应力的分布，使细胞发生变形，通过细胞膜上信号受体与周围细胞发生联系。中外学者针对应力对细胞内部的影响做了很多研究，戚孟春等[9]对MSCs施加高应力，然后观察到细胞骨架F-actin（细胞框架的主要成分）解聚和重排的现象，不仅说明了高应力对细胞骨架的破坏，而且说明细胞骨架是应力的传导途径。此外，在细胞应力与细胞内联系的研究中，学者们发现整合素、第二信使系统、应力反应原件（一种受应力影响的顺式调控原件）都是应力与细胞沟通的重要组成部分[10-12]。而在这个连接通路上，细胞外基质、整合素和细胞骨架所构成的系统把应力从力学信号转变为化学信号起了极其重要的作用。而陈晨等[13]认为，局部黏附蛋白也参与构建了这个系统。而三维培养在生物支架的帮助下，可以使细胞间形成上述的“应力传递系统”。

1.2 三维培养下细胞所受应力 目前，三维细胞培养使用的方法有：细胞团培养、基质覆盖培养、旋转烧瓶培养、旋转细胞培养系统、微载体培养、微囊化培养等[14]，这几种方法给细胞所提供的力学因素有利于促进其增殖分化和形成外基质。能对细胞产生影响的应力目前主要包括微重力、剪切力、张力和压力，在MSCs分化方面，流体静压也可以促进其向软骨分化。三维培养中能稳定提供的是微重力（旋转生物反应器可以模拟微重力失重状态）和剪切力，而提供的流体剪切力不仅不会引起细胞破损，而且还有利于细胞成骨化[15]。但由于这些培养系统所产生的应力不能方便廉价的提供张力和压力，使外界牵拉力很难应用与细胞培养中。水凝胶基质材料常规都是单纯的弹性材料，不能施加应力，但哈佛的Ovijit等改良了普通的三维水凝胶培养法，其制作的有快速应力松弛性质的水凝胶能够产生的弹性模量为17 kPa，能够诱导MSCs形成天然骨基质。这种方法不仅简化了额外应力的供应，而且还促进MSCs增殖分化[16]，最重要的是水凝胶本来就是三维培养中的骨架材料。

2 应力对MSCs分化的影响

生理状态下，受机体运动及重力的影响，体内细胞的行为与张力、压力、剪切力、重力等应力有着密切的关系，这些应力可能会对机体的生长发育产生重要的影响。

2.1 应力大小与细胞分化 在体外培养过程中发现，外界应力刺激，会对细胞生长产生影响。刘天一等[17]通过用每天2次、每次0.5 h的离心力来处理骨髓MSCs，经1～2个月后观察发现，使用应力的实验组产生了更多的蛋白聚糖，说明MSCs在足够应力的刺激下产生了分化。Chaudhuri等[16]通过控制藻酸盐水凝胶的纳米级结构来调节水凝胶的的应力松弛性能，从而模拟活组织的粘弹行为来进行间充质细胞的培养，实验发现不同的弹性模量会影响干细胞分化的方向，当弹性模量在10 kPa以内时，其主要向脂肪细胞分化；而弹性模量升高到11～30 kPa时，其会向成骨细胞分化；同时在9 kPa和17 kPa时，向脂肪细胞分化的能力降低甚至不分化。Li等[18]通过先使用软骨诱导培养基来对大鼠的MSCs进行前期培养，再对其施加液态静压力和大小为13～36 kPa、频率为0.25 Hz的动态液体压，结果发现Ⅱ型胶原纤维α1和聚集蛋白聚糖的基因表达增加，同时硫酸化糖胺聚糖发生富集，说明在应力的作用下，细胞产生了相应的应答，趋向于软骨分化。

2.2 应力类型与细胞分化 在应力（张力、剪切力、渗透压及微重力）的来源中，渗透压所产生的应力是一个特殊的类型。在机体生理条件下，关节软骨受到的渗透压为350～450 mOsm。Caron等[19]通过研究发现，可以通过提高软骨细胞分化培养基的渗透压来增加MSCs Sox9、Col2α1、aggreca基因的表达。Lu等[20]通过对MSCs施加可调控的流体剪切力，发现不同的剪切力会影响MSCs向成骨或软骨细胞的分化。Alves等[21]用三维培养模式动态灌注的方法，模仿生理条件下关节所受的剪切力，作者将MSCs接种于纤维支架上，实验组放于灌注式生物反应器内培养。实验结果显示含剪切力的实验组MSCs发生了分化。霍建忠等[22]应用三维细胞培养技术，旋转培养系统以20 r/min的转速培养兔MSCs，发现三维应力组的软骨特异性基质和Ⅱ型胶原酶的mRNA的表达明显高于对照组。上述研究表明，应力（张力、剪切力、渗透压及微重力）对MSCs的生长、增殖及分化会产生重要的影响，尤其是在三维培养下，细胞应力的传递系统更完整，对MSCs分化的促进作用更明显，但应力对MSCs分化方向的影响机制尚未研究清楚。

3 未来与展望

目前，以牵拉成骨为代表的Ilizarov技术以其神奇的功效，不断拓宽其应用领域。但治疗周期长、钉道感染、外固定架调整、影响生活等问题难以解决。对于这些问题，不断有学者探索解决的方法，倪明等[23]通过在牵拉成骨动物模型中注入富血小板血浆及脱钙骨基质，探索采用外界干预来缩短牵拉成骨时间的方法。对这类问题的探究或许可以改变很多疑难杂症的治疗方案。而三维培养下研究应力与MSCs分化的关系，可以为解决这类问题提供基础。