Twf1基因对心肌细胞凋亡及NF-κB信号通路的影响研究

慕莉蓉，俞红梅，许欣，刘颖，惠超杰

糖尿病心肌病（DC）是糖尿病患者所特有的心脏并发症，其具体发病机制目前尚未明确[1]。研究显示，糖尿病可增加心血管疾病发生率及病死率，在糖尿病动物模型及患者中均可发现心肌细胞凋亡增加，而长期心肌细胞凋亡增加是导致心力衰竭的一个重要原因[2,3]，因此，降低糖尿病引起的心肌细胞凋亡具有重要意义。细胞骨架调控蛋白Twinfilin（Twf）是在进化上很保守的一个微丝结合蛋白。研究显示，在心肌肥厚中Twf1呈上调表达，对心肌细胞肥大起促进作用[4]，这提示Twf1可能影响心肌疾病的发生发展。目前，Twf1对糖尿病引起的心肌细胞凋亡的影响尚不清楚。本研究用高糖培养的大鼠H9c2心肌细胞来探讨抑制Twf1表达对H9c2细胞凋亡的影响，并初步研究其发生的分子机制。

1 材料方法

1.1 主要试剂和仪器DMEM培养基、葡萄糖均购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；Twf1、p-IκBα、Bax、TNF-α抗体均购自美国Abcam公司；DCFH-DA购自碧云天；脂质体LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司；CCK8试剂购自Dojindo；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；Lowry法蛋白定量试剂盒购自上海生工；酶标仪购自美国Thermo公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 细胞培养大鼠H9c2心肌细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞在DMEM培养液（含有10%小牛血清）中，置于5%体积分数的CO2恒温培养箱（95%空气）中37℃培养，2～3 d后，观察到细胞生长密度达80%以上时，用胰蛋白酶消化细胞后传代。实验选择生长至对数期的细胞。

1.3 细胞分组处理及瞬时转染H9c2心肌细胞分为对照组、NC组、高糖组和Twf1-siRNA组。无胎牛血清的DMEM培养基培养H9c2心肌细胞24 h，予以相应的处理，对照组使用含5.5 mmol/L的葡萄糖的普通培养液培养细胞；NC组瞬时转染无干扰作为的siRNA后用5.5 mmol/L的葡萄糖刺激细胞24 h；高糖组瞬时转染无干扰作为的siRNA后用25 mmol/L的葡萄糖刺激细胞24 h；Twf1-siRNA组瞬时转染干扰Twf1表达的siRNA后用25 mmol/L的葡萄糖刺激细胞24 h。每组设置4个复孔，实验重复3次。

细胞的瞬时转染：参照脂质体Lipofectamine TM 2000转进行转染。转染前1 d将生长至对数期的H9c2心肌细胞接种于24孔板上，细胞生长融合达80%以上时将无干扰作为的siRNA和干扰Twf1表达的siRNA转染细胞，转染后培养箱内保温5 h，更换为含有血清的DMEM培养液继续培养48 h。

1.4 蛋白质印迹在各处理组细胞中加入预冷的裂解缓冲液，4℃超声粉粹后离心取上清，上清即为提取的全细胞蛋白。Lowry法进行蛋白质含量测定，进行12%的SDS-PAGE电泳，上样量体积含30 μg蛋白，电泳结束后将目的胶至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭转好的PVDF膜2 h，洗膜，4℃摇床孵育稀释好的Twf1、p-IκBα、Bax、TNF-α及内参GAPDH抗体（均为1:1000稀释）过夜，洗膜，加入二抗，室温孵育1～2 h，ECL显色液避光显色，凝胶图象分析系统进行吸光度扫描，凝胶自动分析软件分析Twf1、p-IκBα、Bax、TNF-α相对于内参GAPDH的蛋白表达量。1.5 CCK8法检测各组细胞活力以每毫升105个细胞接种生长至对数期的细胞于96孔板，按照1.3分组处理细胞，每组设置5个复孔，于测试前在每孔中加入CCK8试剂10 μl，酶标仪测定各孔的平均吸光度值（OD值，波长为570 nm）。本实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测各组细胞凋亡率将按照1.3分组的各处理细胞用胰蛋白消化后制备成单细胞悬液（105/ml），预冷的PBS洗涤细胞，离心，在沉淀中加入结合缓冲液悬浮细胞，混匀后加入AnnexinV-FITC（250 μg/ml）和PI（250 μg/ml）各5 μl，4℃避光放置10～15 min，上机，行流式细胞术检测。本实验重复3次。

1.7 流式细胞术检测各组细胞ROS含量将按照1.3分组的各处理细胞装入稀释好的1 ml DCFHDA探针，于培养箱内37℃孵育20 min，无血清的培养液洗涤细胞3次，转细胞于流式管中，流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度（发射波长为525 nm，激发波长为488 nm）。荧光强度的大小与ROS水平呈现正相关，因此可以用荧光强度间接反映细胞内的ROS水平。本实验重复3次。

1.8 统计学方法所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各处理组心肌细胞中Twf1的蛋白表达NC组Twf1的蛋白表达与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；高糖组和Twf1-siRNA组Twf1的蛋白表达均高于NC组，差异均有统计学意义（P＜0.05），而Twf1-siRNA组Twf1的蛋白表达低于高糖组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

2.2 抑制Twf1表达提高高糖诱导的H9c2细胞活力CCK8检测各组H9c2细胞活力，高糖组细胞活力低于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05），而Twf1-siRNA组细胞活力高于高糖组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图1 各处理组心肌细胞中Twf1的蛋白表达

2.3 抑制Twf1表达降低高糖诱导的H9c2细胞凋亡通过AnnexinV-FITC和PI双染法，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，NC组、高糖组和Twf1-siRNA组的细胞凋亡率分别为（1.51±0.56）%、（16.65±1.34）%、（9.02±0.98）%，高糖组细胞凋亡率高于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05），而Twf1-siRNA组细胞凋亡率低于高糖组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图2 抑制Twf1表达提高高糖诱导的H9c2细胞活力

图3 抑制Twf1表达降低高糖诱导的H9c2细胞凋亡

2.4 抑制Twf1表达降低高糖诱导的H9c2细胞中ROS含量荧光强度的大小与细胞内的ROS水平呈正相关，因此用荧光强度可间接反映细胞内的ROS水平，流式细胞仪检测各组细胞相对荧光强度，NC组、高糖组和Twf1-siRNA组的相对荧光强度分别为（21.26±2.61）、（67.18±4.32）、（43.56±3.18），高糖组ROS含量高于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05），而Twf1-siRNA组ROS含量低于高糖组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图4 抑制Twf1表达降低高糖诱导的H9c2细胞中ROS含量

2.5 抑制Twf1表达降低高糖诱导的H9c2细胞NF-κB信号上调Western blotting检测NF-κB信号p-IκBα、Bax及TNF-α的蛋白表达，高糖组p-IκBα、Bax和TNF-α的蛋白表达均高于NC组，差异均有统计学意义（P＜0.05），而Twf1-siRNA组p-IκBα、Bax和TNF-α的蛋白表达均低于高糖组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

图5 抑制Twf1表达降低高糖诱导的H9c2细胞NF-κB信号上调

3 讨论

糖尿病心肌病（DC）是引起糖尿病致死致残的主要因素之一，也是目前公认的特异的、独立的心肌疾病。随着糖尿病发病率的不断升高，DC也受到了广泛的关注。心肌细胞的凋亡、肥大和纤维化是DC的主要病理表现，其中，心肌细胞凋亡在DC形成中有着重要作用[5,6]。已有研究显示，高糖可引起心肌细胞的凋亡，但引起凋亡的具体分子机制尚未明确[7]。细胞骨架调控蛋白Twinfilin（Twf）是在进化上很保守的一个微丝结合蛋白，哺乳动物有Twf1和Twf2，Twf1主要在心肌细胞表达。有研究显示，Twf1在小鼠心肌细胞系过表达可出现蠕虫状异常纤维及应力纤维减少[8]；心肌细胞中Twf1表达升高可引起细胞表面积增大，并可引起心肌肥厚分子标记物表达的升高；miR-1表达下调可引起Twf1表达的上调，进而促进心肌肥厚的发生及发展[9]；也有研究指出，miR-30e可通过靶向抑制Twf1而对心肌肥厚进行调控[10]。这些都提示，Twf1可促进心肌肥厚的发生发展。目前，Twf1对糖尿病引起的心肌细胞凋亡的影响还不清楚。本研究结果显示，高糖可引起细胞内Twf1表达升高，抑制Twf1表达可提高由高糖引起的心肌细胞活力降低，并降低由高糖引起的心肌细胞凋亡增加。这提示抑制Twf1表达可能对DC起到保护作用。

氧化应激与心肌细胞凋亡密切相关，ROS是细胞内最为重要的一个氧化代谢自由基，病理状态下，ROS的大量蓄积可加重氧化应激对核酸、蛋白质和脂质造成的损伤，进而破坏细胞的生理、结构和代谢，最终引起机体的生理病理学改变[11,12]。有研究显示，长期的高血糖可引起糖基化终末产物在心肌中过多沉积及晚期糖基化终末产物受体表达升高，糖基化终末产物与糖基化终末产物受体两者结合后可通过激活NF-κB等过程引起氧化应激[13,14]。本研究结果显示，抑制心肌细胞Twf1表达可降低由高糖引起的细胞内ROS含量的升高。NF-κB是一个较为敏感的调节免疫、炎症等的重要的转录因子，有研究发现，NF-κB信号的激活与DC发生密切相关，激活的NF-κB可调控TNF-α、IL-6、IL-1β等多种细胞因子和炎症因子，进而参与心肌的炎症损伤[15-17]。TNF-α可诱导心肌细胞凋亡，DC中TNF-α的表达升高[18,19]。Bax是Bcl-2家族成员之一，发挥促凋亡作用，在DC中表达升高[20]，本研究检测NF-κB信号磷酸化的IκBɑ及TNF-α和Bax的表达，发现抑制Twf1表达可显著降低高糖引起的磷酸化的IκBɑ、TNF-α和Bax的表达。这提示Twf1可通过下调NF-κB信号对DC起保护作用。

综上所述，抑制H9c2细胞Twf1基因表达可逆转高糖诱导的细胞活力降低及凋亡的增加，其机制可能与细胞内ROS含量降低及NF-κB信号下调有关。本研究可能为DC的分子靶向治疗提供了一定的理论基础，目前尚需要进一步的深入研究。