附子药理作用的分子机制研究进展

★ 邓晓红 黄建华 董竞成

(1.复旦大学附属华山医院中西医结合科 上海 200040;2.复旦大学中西医结合研究院 上海 200040)

附子，被誉为中药“回阳救逆第一品”，是毛茛科乌头属植物乌头的子根，味辛、甘，性大热，有毒，具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效，主治亡阳虚脱，肢冷脉微，阳萎，宫冷，心腹冷痛，虚寒吐泻，阴寒水肿，阳虚外感，寒湿痹痛等多种疾病。现代研究发现附子成分复杂，主要成分是乌头类生物碱、多糖、皂苷等，具有强心、保护心肌细胞、抗心律失常、抗炎和镇痛、抗肿瘤等广泛的作用[1]。附子药理作用的分子机制的研究，可进一步揭示药物作用的基础，而且可以对相关基团进行修饰以提高药物的治疗效应。鉴于药物作用分子机制研究的重要性，本文检索了PubMed数据库中收录的有关附子及其成分的研究文献，按其作用机制的不同进行分类，重点总结了附子及其有效成分药理作用的分子机制的异同，为以后的研究提供一定的理论基础。

1 β肾上腺素能受体

肾上腺素能受体(Adrenergic receptor, AR)是鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联受体的超家族成员，可分为ɑ受体和β受体两种。目前已知的ɑ肾上腺素能受体亚型包括ɑ1和ɑ2，β肾上腺素能受体则有3个亚型，分别是β1，β2和β3受体。其中ɑ1受体主要分布在血管平滑肌，可引起血管收缩，血压升高；ɑ2受体主要分布在去甲肾上腺素能神经的突触前膜，可使去甲肾上腺素分泌减少。β1受体主要分布于心血管系统，可引起心率增快，心肌收缩力增强；β2受体主要分布于支气管平滑肌、血管平滑肌、心肌等，介导支气管平滑肌松弛、血管扩张等作用。Yang等[2]运用虚拟筛选和双荧光素酶报告基因检测的方法发现附子中45种化合物能够作为β2受体激动剂，其主要作用成分是烷醇胺-二萜类生物碱和单酯-二萜类生物碱。Bai等[3]通过转染细胞系CHOβ2-AR-CRE-EGFP进一步证实去甲乌药碱能够激活β2受体从而松弛气管平滑肌，并改善支气管哮喘模型豚鼠的症状。Liu等[4]实验明确了去甲乌药碱通过β2受体而不是ɑ或者β1受体介导使心肌细胞增强K+分泌和Na+吸收，再通过Na+-Ca2+交换机制，使细胞内Ca2+增多，从而发挥正性肌力作用。Wu等[5]实验亦证实去甲乌药碱通过选择性激活β2受体，并引起PI3K/AKT级联反应，从而拮抗心肌细胞凋亡和心肌梗死诱导的缺血再灌注损伤。但同时据报道，去甲乌药碱也具有α1受体拮抗剂和弱的α2受体激动剂的作用[6-7]。此外，Kam SC等[8]研究发现，去甲乌药碱以剂量依赖型方式诱导大鼠阴茎海绵体松弛，这种松弛可被β受体阻断剂阻断，因此去甲乌药碱有希望作为一种通过β受体介导治疗勃起功能障碍的先导化合物。Nojima H等[9]用放射性同位素检测方法发现去甲乌药碱通过β受体介导在小鼠运动神经末梢释放乙酰胆碱，从而发挥镇痛作用。

现有观点多认为附子的“回阳救逆”是作为一种β受体激动剂发挥强心作用，但上述研究表明附子多通过激动β2受体发挥松弛平滑肌、保护心肌细胞等作用，而不是通过激动β1受体发挥强心作用。一种可能是附子对肾上腺素能受体作用的现有研究主要集中在其成分去甲乌药碱，附子可能通过其他成分比如乌头碱及其代谢产物发挥强心作用；另一种可能是附子通过其他途径，比如线粒体途径发挥“回阳救逆”的功效，这都需要进一步研究。

2 NF-κB信号通路

核转录因子κB(Nuclear factor κB，NF-κB)是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，广泛存在于多种组织细胞中，参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡以及肿瘤发生等多种生物过程。NF-κB是属于Rel家族的转录因子，目前已经发现哺乳动物细胞内NF-κB家族包括5个成员，分别是p65(Rel A )，Rel B，c-Rel，p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)。细胞外的应激因素如脂多糖、前炎性细胞因子、有丝分裂原等均可引起NF-κB信号转导途径的激活。Zeng等[10]研究发现，乌头类生物碱乌头原碱能够通过抑制NF-κB活化从而抑制RAW264.7细胞中由核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)诱导的破骨细胞分化，表明乌头原碱可以通过下调NF-κB信号通路从而抑制破骨细胞的生成，揭示了附子治疗风湿性关节疾病的一种可能的机制。Kang等[11]发现附子成分去甲乌药碱能够在Raw264.7细胞中通过抑制NF-κB活化从而抑制由脂多糖和干扰素-γ诱导的NO产生和iNOS表达，发挥抗炎作用，并且去甲乌药碱可能在脓毒性休克或者内毒素诱导的炎症性疾病等心肌收缩力降低的情况下更有效。在体内实验中，Luo等[12]发现附子水提物可以提高肝功能从而减轻大鼠急性肝衰竭的严重程度，其机制可能为下调细胞外高迁移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)从而降低Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)，最终致NF-κB下调发挥肝细胞保护作用。同时作者观察到附子水提液可以显著降低caspase-3 mRNA水平，而在受损组织NF-κB mRNA表达与caspase-3水平密切相关，由此推测附子水提液可能通过抑制caspase-3途径减少了肝细胞的凋亡。

上述研究表明附子水提物对NF-κB信号转导通路具有抑制作用，但具体机制的研究仅处于起始阶段，其上下游机制仍未明确，需进一步研究。

3 AMPK信号通路

腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)信号通路中，AMPK是一种异源三聚体蛋白，作为感受细胞能量的开关在细胞的代谢调控中起到十分重要的作用。AMPK的活性主要受细胞中ADP/ATP比值的调节，可以被任何造成细胞内ATP减少的应激刺激而激活，这些刺激包括代谢性产物、氧化应激、缺氧、低糖等。mTOR是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，AMPK可通过抑制其下游信号分子mTOR调控细胞自噬[13]。Liao等[14]研究发现，附子多糖在H9c2心肌细胞中通过AMPK/mTOR信号通路的活化增加细胞自噬从而减轻因缺血缺氧诱导的心肌细胞死亡。PGC-1ɑ在线粒体生物合成和氧化代谢中发挥重要作用，研究证实AMPK活化可增加PGC-1ɑ转录[15]。Wang等[16]发现，附子多糖在Schwann细胞中可通过激活AMPK-PGC-1ɑ信号通路从而减轻由高糖引起的氧化损伤，但上游具体机制尚需进一步研究。羟甲基戊二酸CoA(HMG-CoA)还原酶是AMPK下游的一个重要靶点，是调节甘油三酯合成的关键酶。Huang等[17]发现附子多糖可降低高胆固醇大鼠模型的胆固醇含量，这种作用与降低HMG-CoA还原酶的表达有关。

4 PI3K/AKT信号通路

磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol-3-kinases)/AKT信号通过广泛存在于细胞中，参与细胞生长、增殖，调节细胞分化。PI3K由p85和p110组成，其分别具有调节和催化功能，相对分子量分别为85×103和110×103。PI3K的p110亚基与蛋白激酶具有同源性，本身具有Ser/Thr激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。Akt又称为蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶，是PI3K/Akt信号转导通路的核心。PI3K激活的Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等，而介导多种生长因子等诱发的细胞增殖，经多种途径促进细胞存活。Wu等[5]研究发现去甲乌药碱可以通过激活PI3K和Akt磷酸化以抑制心肌细胞凋亡，减轻缺血再灌注引起的心肌损伤，并且PI3K抑制剂Wortmannin可阻断这种抗凋亡作用和Akt磷酸化。另有报道称发现在低氧条件处理下的C6细胞中，去甲乌药碱可通过激活PI3K/Akt信号通路，并引起下游转录因子E2相关因子2(Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Nrf-2)转位，从而诱导血红素氧合酶1(Heme Oxygenase 1, HO-1)产生发挥保护脑细胞作用，这种作用可被PI3K抑制剂LY 294002所阻断[18]。Chen等[19]亦报道四逆汤主要成分去甲乌药碱联合6-姜辣素可通过上调PI3K/Akt抑制心肌细胞凋亡。另外，Du等[20]发现乌头碱可以通过抑制PI3K/Akt通路发挥抗黑色素瘤作用。

综上，附子成分去甲乌药碱可激活PI3K/Akt通路，而乌头碱则可抑制PI3K/Akt通路。附子不同成分在不同细胞中可发挥截然相反的作用，这是不是可以部分揭示临床上“异病同治”和中药具有双向调节作用的分子机制，也是值得进一步研究和探讨的问题。同样的，有关附子及其成分对PI3K/Akt信号通路影响的研究，也应明确其上下游机制。

5 BDNF信号通路

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经营养因子家族中一个很重要的分泌蛋白，广泛分布于中枢神经系统和周围神经系统，尤其在海马的表达水平最高。BDNF通过与酪氨酸激酶B受体(tyrosine receptor kinase B, TrkB)结合，使酪氨酸激酶自身磷酸化，从而实现对细胞存活、生长、分化和突触可塑性发挥多重调节作用。Yan等[21]研究发现，附子多糖可显著升高社交失败小鼠海马中的BDNF从而发挥抗抑郁作用，并且TrkB抑制剂K252a可完全阻断这种作用。在BDNF信号通路的下游，环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)是胞内与抑郁症相关信号通路的一个交汇点，能够调节多种神经系统功能。在卵巢摘除的抑郁模型雌性小鼠中，Liu等[22]发现附子总生物碱可上调小鼠海马和额叶皮质中BDNF表达和CREB信号转导通路活性，但未发现两者之间的相关性。并且比较了附子总生物碱与附子多糖抗抑郁作用的不同，发现附子总生物碱表现出更快速的抗抑郁作用，而附子多糖长期抗抑郁效果更好。

6 MAPK及其他可能的分子靶标

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号途径存在于所有生物体内的大多数细胞中，调节不同的进程，包括增殖、分化以及凋亡。细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)是MAPK家族中的重要成员，有报道发现附子水提物可通过激活ERK1/2信号通路促进小鼠骨髓间充质干细胞增殖[23]。Du等[20]发现乌头碱通过抑制MAPK/ERK1/2信号通路调节黑色素瘤细胞中增殖细胞核抗原和凋亡相关蛋白及mRNA表达，从而发挥抗黑色素瘤作用。

此外，Liou等[24]发现附子炮制品黑顺片在糖尿病大鼠模型中，可以通过激活骨骼肌和肝脏中μ阿片受体而降低血糖。Omiya等[25]发现附子的镇痛作用可能与κ阿片受体和多巴胺受体有关。Li等[26]研究发现附子总生物碱能够通过GABAA-苯二氮受体复合物发挥抗癫痫作用，降低癫痫模型小鼠的死亡率。

7 小结

附子及其成分的药理作用涉及多种信号转导通路和分子靶点，但由于附子主要有效成分乌头碱有毒，所以现有的研究多集中在乌头碱以外的成分，并且分子机制表现出模型依赖、组织特异等特点，这些因素都增加了准确描述附子药理作用分子机制的复杂性和难度。通过梳理上述文献，对今后附子药理效应分子机制的研究有以下几点提示：①把研究目标部分转向附子的主要有效成分同时也是有毒成分乌头类生物碱；②对于上述信号转导通路及分子靶标的研究，需要进一步明确引起该通路或靶点变化的上游机制和发生生理效应的下游机制；③作用靶点的结构需进一步明确，为新药的开发提供基础；④不同通路之间的交叉会话也是重要的研究内容；⑤将作用靶点与信号通路等信息联系起来，弄清附子发挥药理作用的整个过程，并且对作用靶点、分子机制和药理作用之间的关系做进一步验证；⑥寻找新的信号转导通路和作用靶点。附子在中医临床上具有广泛的应用，其成分复杂，对其药理作用分子机制的研究或许能成为中药现代化和中药贡献现代医学的途径之一。

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