沙眼衣原体免疫层析法应用研究进展

顾伟鸣

（上海市皮肤病医院检验科，上海 200443）

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是一种细胞内寄生的微小微生物，分为小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物型，后2种与人类疾病有关，可引起人类泌尿生殖道感染，如男性尿道炎、附睾炎，以及女性宫颈炎、盆腔炎、宫内感染等，孕妇生殖道感染Ct可导致新生儿眼炎和肺炎[1]。世界卫生组织估计每年有1.31亿新感染者[2-3]。美国疾病与预防控制中心2016年报告Ct新发病例达159万例，较2015年增长了4.7%[4]。我国105个性病监测点报告生殖道Ct感染发病率由2008年的32.48/10万增长到2015年的37.18/10万，年均增长1.95%[5]。生殖道Ct感染已经成为全球重要的公共卫生问题之一[2-5]。

1 Ct检测方法

Ct感染是我国国家监测病种之一。由于Ct感染的潜伏期长、临床表现和症状不典型，主要以实验室检测结果作为临床诊断依据。Ct检测方法主要有3种：细胞培养法、分子生物学方法和免疫学方法。细胞培养法是传统的“金标准”，然而其操作复杂，需要高水平的专业技术人员，目前仅有少数实验室进行科学研究时采用。随着现代分子生物学理论和检测技术的进步，分子生物学方法无论在敏感性还是特异性方面，都超越了细胞培养方法和免疫学方法，被认为是替代的“金标准”。但是从实验室技术能力和质量监管的角度看，开展分子生物学方法需要技术准入门槛和特定的实验室及设备条件，短时间内无法在基层医疗机构普及。而免疫学方法，尤其是免疫层析法检测技术，由于操作简便、检测周期快、特异性较好等优势，在全国各地不同级别的医疗机构中普遍开展。截止到2018年3月，国家食品药品监督管理总局的网站显示有3种检测衣原体抗体和10余种检测衣原体抗原的免疫层析法试剂盒，1种直接免疫荧光法试剂盒。本文主要介绍以抗原为靶标的Ct免疫层析法检测技术的特点和应用价值。

2 免疫层析法分类

免疫层析技术（immunochromatography assay，ICA）是20世纪80年代初发展起来的一种基于抗原抗体特异性免疫应答的检测技术，对细胞或样本中的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位及定性检测，汇集了免疫检测、标记、层析等综合学科技术。根据示踪标记物将ICA分为免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique，ICGT）和免疫乳胶技术（immune latex technique，ILT）。

ICA按层析过程液体流动方向分为垂直流向的免疫渗滤分析（dot immunofiltrtion assay，DIFA）和水平流向的免疫层析分析（dot immuno-chromatography assay，DICA）。免疫层析将已知靶标的特异性抗体（单抗或多抗）包被于硝酸纤维素膜上的特定位置作为检测带（T），可捕获免疫复合物的二抗包被于临近位置作为质控带（C），标记了示踪颗粒的特异性抗体（单抗标记结合物）附于样品滴加垫上并干燥。检测时，样本中的水分可溶解单抗标记结合物，若样本中有待测抗原，则会发生抗原抗体反应，形成的免疫复合物A（标记抗体-抗原）借助毛细管作用向吸水垫方向移动，到达T位置时，被特异性抗体捕获形成复合物B（标记抗体-抗原-包被抗体），在T位置聚集形成肉眼可见的免疫复合物条带；若样本中无待检抗原，则不能形成肉眼可见的免疫复合物条带。游离的标记抗体或复合物A越过T到达C，与二抗发生反应，形成复合物D（标记抗体-二抗）或复合物E（复合物A-二抗），聚集并产生肉眼可见的免疫复合物条带，提示检测有效。

2.1 ICGT

ICGT是以胶体金作为示踪标记物检测抗原的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、维生素C、枸橼酸钠或鞣酸等的作用下，聚合成为稳定、特定大小、胶体状态的纳米金颗粒。球形的纳米金颗粒对蛋白质有很强的吸附能力，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而被应用于定性或半定量的快速免疫检测。

2.2 ILT

ILT以红色乳胶微球作为示踪物来标记抗体，制成特异性试剂。由羧基修饰的聚苯乙烯微球表面呈高度疏水性，与配体最大程度结合。乳胶微球被清洗、稀释和活化后，利用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和乳胶微球上的羧基耦合形成一个O-异酰基脲结构，这一活化中间物与抗体上的-NH2基团形成酰胺交联，再利用N-基琥珀酰亚胺形成更稳定的交联产物，被用于定性或者半定量衣原体抗原检测。

3 Ct-ICA临床应用

Ct- ICA采用抗衣原体脂多糖单克隆抗体检测Ct。由于是针对衣原体属的抗原，理论上检测阳性结果涵盖了所有衣原体属的感染。从性传播感染（sexually transmitted infection，STI）流行病学特征来看，引起泌尿生殖道感染的主要是Ct D～K血清型，以及在我国少见的可引起性病性淋巴肉芽肿的L血清型[1]。

鉴于Ct抗原检测的样本为泌尿生殖道的分泌物，含有较多未知蛋白和杂质，因此泌尿生殖道Ct的检测试剂采用双抗体夹心ICA。随着现代即时诊断（point-of-care testing，POCT）标记技术和放大技术的飞速进步[6]，临床普遍采用Ct-POCT开展常规的诊疗，世界卫生组织推荐在高危人群中采用POCT筛查STI，以期达到早期诊断、及时治疗、阻断传染源的目的[7]。

2006年，美国国家生物医学影像和生物工程研究所提出了一项全国性倡议：POCT对于解决资源紧张地区和贫穷国家性传播疾病的流行具有巨大的潜力[8]。ROMPALO等[9]在2008年3月—2009年4月对美国马里兰州巴尔的摩市和俄亥俄州辛辛那提市的STI患者进行定性检测，检测快速、操作简便和结果易于读取的POCT得到了他们的青睐。POCT具有更好的保密性、隐私性和便利性，不仅方便家庭使用，也可以应用于临床，医生可以根据阳性结果立即开展治疗。2010年4月—2011年2月在巴尔的摩市招募了154名妇女进行衣原体检测，Ct-POCT的敏感性达到92.9%，测试成本为33.48美元，比核酸扩增技术（nucleic acid amplification technique，NAAT）更高效，费用更低[10-11]。HSIEH等[12]对218名美国性病专科医生进行的调查结果表明，POCT是性传播疾病门诊首选的检测方法，而检测的敏感性是性病专科医生关心的首要问题。

我国Ct-POCT的临床应用始于20世纪90年代初，由于衣原体感染问题日益受到重视，进入21世纪后，特别是近年来，我国放开“二孩”政策，育龄妇女的生殖道Ct感染关乎下一代健康问题[13]，Ct-POCT无论在普及范围还是在使用数量方面，都达到了前所未有的程度。但是大量临床实践表明，Ct-ICA检测敏感性低的问题逐步成为我国衣原体感染诊断重要的影响因素。临床评估发现，一个进口品牌Ct-ICA试剂检测女性宫颈样本的敏感性只有49.3%[14]，而另外一个进口品牌Ct-ICA检测男性尿道样本的敏感性仅57.14%[15]。DOMMELEN等[16]在2008年对772位女性的自采样本进行检测时发现，以核酸检测方法为参照，3个品牌Ct-ICA的检测敏感性为12%～27%。HISLOP等[17]发现Ct-ICA检测宫颈样本的敏感性为39%～65%，检测男性首段尿样本的敏感性为47%～77%。HUPPERT等[18]系统分析了4个国际知名Ct-ICA品牌的9份临床评估报告中5 287例女性宫颈样本，结果显示：在女性人群中，这4种Ct-ICA检测试剂的检测敏感性为25%～95%。

随着现代生物医药技术的进步，一种改良Ct-ICA的检测敏感性有了很大程度的提升[19]，采用脂多糖抗原优势表位嵌合重组蛋白诱导衣原体种属特异性抗体，其中1个抗体用于固相包被，2个抗体标记胶体金探针，通过增加衣原体抗原捕捉能力达到提高检测敏感性的目的。有研究结果表明，改良Ct-ICA检测女性高危人群的敏感性接近聚合酶链反应，检测男性高危人群的敏感性为73.2%[19]，比蒋娟等[15]的研究结果提升了16%，而在低危人群中，改良Ct-ICA的检测敏感性与聚合酶链反应仍然有较大差距[19]。另一项对英国1 349例性病门诊女性患者采用Ct-ICA进行检测的研究结果表明，同样以核酸检测做为参比方法，Ct-ICA的检测敏感性高达81.6%～83.5%[20]。

以往的临床应用评估有以下特点：（1）不同报道的应用评估研究时间跨度近30年，正处于免疫标记技术和生物工程技术快速发展的阶段，Ct-ICA试剂质量不可同日而语；（2）研究对象有高危和/或低危人群，每项研究的样本量差异悬殊，敏感性为25%～95%。提示Ct-ICA适用范围具有局限性；（3）每项研究都是采用一种待评估Ct- ICA试剂与细胞培养法和/或核酸检测法相比较的方式，其中一些研究仅仅是临床检测结果的回顾性分析。没有1项研究是在相同背景下对不同Ct-ICA试剂进行的平行评估；（4）对于不同研究人群，Ct-ICA抗原检测的特异性都超过95%。提示Ct-ICA检测特异性好，但敏感性因试剂品牌和检测人群不同而差异较大。

4 结语

综上所述，泌尿生殖道Ct-ICA是各级医疗机构普遍采用的方法，特别是对高危人群的检测在防控衣原体感染蔓延工作中有着重要的价值。随着生物医药技术革命性的进步，Ct-ICA试剂质量有了较大的提高。但由于试剂的原料和生产工艺等因素影响，不同品牌Ct-ICA试剂检测性能差异较大，目前为止未发现关于Ct-ICA的系统性评价。我们在性病检测室间质评中也发现了不同品牌检测试剂敏感性差异显著的问题。有必要制定专门的Ct-ICA检测性能的评估方案，以系统了解我国Ct-ICA现状，推荐临床适用范围和路径。