非经典微生物感染的病原学诊断及其耐药性分析

赵 虎， 张景皓， 张艳梅

（复旦大学附属华东医院检验科，上海 200040）

随着侵入性诊疗手段以及免疫抑制剂、激素和抗菌药物等的大量应用，非结核分枝杆菌（nontuberculous Mycobacterium，NTM）等非经典微生物引起的感染日趋多见[1]。NTM引起的感染的临床表现和影像学表现与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的感染的临床表现非常相似，但治疗方法截然不同。另外，由沙眼衣原体和支原体等非经典微生物引起的人泌尿道感染的发病率也逐年增高[2]，严重危害患者的健康。为了解上海地区非经典微生物的分布与感染、耐药性状况，本期“非经典微生物感染的病原学诊断与药物敏感性分析”专题汇集了非经典微生物感染相关的1篇综述、3篇专著和1篇病例报道，阐述了NTM、支原体和沙眼衣原体的实验室诊断方法及其耐药性分析结果，以期为临床诊疗提供参考。

1 NTM的病原学诊断及耐药性分析

NTM是指除结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。根据NTM的生长速度可分为快速生长分枝杆菌（培养3～7 d，肉眼可见菌落）和缓慢生长分枝杆菌（培养7 d以上，肉眼可见菌落）[3]。快速生长分枝杆菌包括偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌，主要存在于自然环境中，可引起呼吸系统疾病，症状类似结核病。偶发分枝杆菌可引起人的局部感染或肺部感染，对现有的抗结核药物均耐药；龟分枝杆菌可导致免疫力低下的患者外伤后软组织病变及手术后继发感染，也可引起肺部感染；脓肿分枝杆菌常存在于自来水中，可引起医院感染暴发，导致肺部感染的发病率和死亡率增加[3]，还可引起免疫力缺陷患者侵入性诊疗后的血流感染。刘淑芬等撰写的病例报道《从血液中分离1株脓肿分枝杆菌的报道》详细阐述了1例接受化疗的胃癌晚期患者脓肿分枝杆菌血流感染的情况，其感染可能与免疫抑制相关。缓慢生长分枝杆菌可引起人类感染的菌种较多，最常见的有鸟-胞内分枝杆菌复合菌组、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和海分枝杆菌等，可引起肺部、淋巴结、皮肤及皮下软组织病变，可引起免疫功能受损患者的传染性疾病[5]。

随着免疫缺陷性疾病和免疫抑制剂使用的增多，由NTM感染导致的疾病，尤其是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染或获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）合并NTM感染患者明显增多[6]。我国1979—2010年的5次全国结核病流行病学抽样调查结果显示，NTM分离率呈逐年上升的趋势[7]。蔡金凤等撰写的论著《2012—2016年上海地区AIDS患者分枝杆菌分离及耐药情况分析》报道了分离自1 940例AIDS患者4 648例临床样本的不重复分枝杆菌409株，包括199株MTB（48.66%）和210株NTM（51.34%），NTM在痰液中的分离率最高，其次是血液，应引起临床医生的高度重视。2002—2014年，我国台湾地区疑似肺部分枝杆菌感染患者中，MTB的占比从82.50%下降至41.18%，而NTM占比从17.50%上升至58.82%[8]，反映出我国NTM感染呈上升趋势。

NTM感染具有与结核病相似的临床表现，但是治疗、预防措施与结核病有明显不同，不同的菌种对抗菌药物的敏感性也不同，所以对分枝杆菌感染的菌种鉴定在流行病学调查及临床诊治方面均有重要意义。

目前常用的检测方法中，抗酸染色镜检无法区分分枝杆菌种类，且敏感性弱，容易出现假阴性结果。分枝杆菌培养是临床诊断的金标准，也是目前确诊的主要方法，但其检测周期长，无法及时向临床提供实验室诊断结果。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）后直接测序、套氏PCR、限制性片段长度多态性PCR和多重分子信标探针芯片等分子生物学检测技术，能快速、准确地鉴定菌种，并可直接对分枝杆菌核酸及耐药基因多重靶点进行特异检测，为分枝杆菌及其耐药基因的鉴定及流行病学调查提供了新的技术手段[6]。

不同的NTM在治疗前需遵循美国临床实验室标准化协会的标准进行药物敏感性试验。对于未经治疗的鸟-胞内分枝杆菌复合菌组感染患者，推荐进行克拉霉素敏感性试验。对未经治疗的堪萨斯分枝杆菌感染患者，首先进行克拉霉素和利福平药物敏感性试验，如有必要还可进行对阿米卡星、环丙沙星、乙胺丁醇、异烟肼、利奈唑胺、莫西沙星、利福布汀、链霉素、复方磺胺甲噁唑的药物敏感性试验，异烟肼和链霉素对临床治疗有效但尚未建立敏感和耐药的折点。不推荐进行海分枝杆菌分离株常规药物敏感性试验，在必要的情况下，可对阿米卡星、环丙沙星、克拉霉素、多西环素、米诺环素、乙胺丁醇、莫西沙星、利福平、利福布汀和复方磺胺甲噁唑进行药物敏感性实验。快速生长分枝杆菌常规药物敏感性试验应包括阿米卡星、头孢西丁、环丙沙星、克拉霉素、多西环素、亚胺培南、利奈唑胺、美罗培南、莫西沙星、复方磺胺甲噁唑和妥布霉素（仅限于龟分枝杆菌）[9]。大量的研究结果表明不同地区的NTM耐药率有显著差异，治疗前进行药物敏感性试验非常必要[10-11]。

2 支原体的病原学诊断及耐药性分析

支原体是一群无细胞壁、能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞微生物，共有6个属，其中支原体属和脲原体属与人类疾病相关[5]。目前对人类致病的最常见的支原体有肺炎支原体、人型支原体和解脲脲原体。肺炎支原体主要通过呼吸道传播，老年人和青少年易感，是引起社区获得性肺炎的主要病原体[11]。人型支原体和解脲脲原体可在大多数成人的下生殖道中分离到，可引起人体泌尿生殖系统的感染，是非衣原体、非淋球菌性尿道炎的主要病原体。除引起尿道炎外，人型支原体和解脲脲原体还可引起不孕不育症、慢性前列腺炎、宫颈炎、盆腔炎等严重危害生殖健康的疾病[12]，宫内感染后可通过垂直传播引起危及新生儿生命的中枢神经系统感染[13]。

目前，美国、英国等发达国家已经逐步对25岁以上、有性生活者常规进行支原体、衣原体感染的筛查，我国也对备孕女性和孕产妇进行该病原体的常规检测，为易感人群的预防和治疗提供了病原学依据。

支原体培养是目前我国检测支原体的主要手段，通常使用液体培养基直接检测并同时进行支原体药物敏感性试验。但这种方法有时候会受到细菌或真菌的污染导致假阳性，因此需要固体培养基确认菌落形态才能最后作出诊断。培养法对样本转运的条件和时效性要求较高，在临床应用中会出现部分假阴性结果。实时荧光定量PCR和实时荧光核酸恒温扩增技术等分子生物学方法与培养法比较敏感性和准确率大大提高，但无法同步为临床提供药物敏感性试验结果[14-15]。

近年来，由于支原体引起的生殖道感染逐年增多，不规范治疗和盲目用药导致耐药菌株不断增加，临床疗效逐渐减弱。目前，我国绝大多数临床实验室采用商品化试剂盒进行的药物敏感性试验只能将结果定性为敏感、中介和耐药3种情况。美国临床实验室标准化协会推荐使用微量肉汤稀释法或琼脂稀释法进行支原体药物敏感性试验，目前仅有左氧氟沙星、莫西沙星、四环素、红霉素、泰利霉素有参考折点[16]，其他抗菌药物的药物敏感性如何判断，是一个急需解决的问题。另外，不同种类、不同地区支原体感染的药物敏感性试验结果也有显著差异。周运恒等撰写的《微量稀释法检测男性不育患者脲原体的耐药性分析》分析了解脲脲原体对常用的12种抗菌药物的药物敏感性。其中多西环素、阿奇霉素、左氧氟沙星和莫西沙星的敏感率分别为96.9%、100%、29.7%和79.4%，提示左氧氟沙星可作为临床经验用药的首选。有研究结果表明，北京某地区解脲脲原体对多西环素、阿奇霉素和左氧氟沙星的敏感率分别为93.75%、89.58%、76.04%[17]，重庆部分地区对多西环素、阿奇霉素和左氧氟沙星的敏感率分别为98.5%、70.9%、14.6%[18]，表明不同地区支原体耐药率有显著差异，治疗前进行药物敏感性试验很有必要。

3 沙眼衣原体的实验诊断及耐药性分析

沙眼衣原体是一类严格真核细胞内寄生的原核细胞型微生物，需要通过宿主细胞繁殖。其在宿主细胞内的生长繁殖周期有2个生物相：原体存在于细胞外，无繁殖能力，传染性强，对抗菌药物不敏感；始体存在于细胞内，繁殖能力强，但无传染性，对抗菌药物敏感。沙眼衣原体引起的疾病可累及眼、生殖道、直肠等多个脏器，其引起的生殖道感染已成为最常见的性传播疾病之一，常见于非淋菌性尿道炎、宫颈炎、输卵管炎、附睾炎等，也可导致母婴传播。女性的上行感染可引起盆腔炎，导致不孕和异位妊娠[19]。由于沙眼衣原体感染是临床常见的性传播疾病，且感染者通常无症状，因此及时、准确的实验室检查可为感染者及时治疗提供依据，防止再度传播。

沙眼衣原体的实验室检测方法包括吉姆萨染色、碘染色和帕氏染色镜检，可发现沙眼衣原体包涵体，但敏感性及特异性低，只适用于新生儿眼结膜刮片的检查；细胞培养法的优点为特异性几乎为100%，但方法复杂，难以在临床工作中广泛应用[20]；采用酶联免疫吸附试验、直接免疫荧光法或免疫层析法检测沙眼衣原体抗原是目前我国最常用的方法，但敏感性及特异性较低。顾伟鸣撰写的综述《沙眼衣原体免疫层析法应用研究进展》详细阐述了免疫层析法在沙眼衣原体实验诊断中的应用，提示泌尿生殖道沙眼衣原体免疫层析法检测，尤其在高危人群中的检测对防控衣原体感染蔓延有着重要的价值。但由于产品的原料和生产工艺等因素影响，不同品牌的沙眼衣原体免疫层析法检测试剂的性能差异较大，应合理选用。随着生物医药技术革命性的进步，沙眼衣原体免疫层析法试剂盒的质量有了较大的提高，泌尿生殖道沙眼衣原体免疫层析法检测在各级医院普遍被采用。沙眼衣原体核酸检测方法是目前诊断沙眼衣原体感染敏感性和特异性最高的方法[21]。陈凯等撰写的《7种国产沙眼衣原体核酸检测试剂的平行比较》从检测样本浓度、样本类型、质控、敏感性和特异性等方面详细分析了7种国产沙眼衣原体核酸检测试剂的检测性能，研究结果表明国产核酸试剂的特异性均超过95%，与美国食品与药品监督管理局批准的沙眼衣原体核酸检测试剂的特异性相当。但国产沙眼衣原体核酸检测试剂中部分试剂的敏感性尚未达到90%，表明国产试剂应在敏感性方面加大研发力度。

由于沙眼衣原体始体存在于细胞内，所以选用的抗菌药物应具有良好的细胞穿透性；相关临床用药指南建议使用阿奇霉素、多西环素、米诺环素、四环素、红霉素、罗红霉素、克拉霉素、氧氟沙星和左氧氟沙星等抗菌药物[22]。鉴于细胞培养沙眼衣原体方法复杂，不能应用于临床，故无法进行常规药物敏感性试验。

4 总结与展望

随着侵入性诊疗手段以及免疫抑制剂、激素和抗菌药物等被大量使用，各种非经典微生物感染所致疾病也逐年增多并严重危害患者的健康，应引起临床的高度重视。早期诊断和合理用药是控制感染的关键。但目前NTM、支原体和沙眼衣原体等非经典微生物产生的耐药性已严重影响了临床治疗。本专题的5篇文章，从不同的角度分别阐述了非结核分枝杆菌、支原体和沙眼衣原体的病原学诊断方法以及耐药性，为非经典微生物感染的实验室诊断及临床治疗提供了参考。

综上所述，了解不同微生物的特点并研究其耐药机制，有助于合理用药，促进新药研发，同时也可为临床合理选用有效的药物、迅速控制感染、减少耐药性的产生提供重要依据。