石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的相关性能

许雅楠, 吕 峰, 李燕妹, 林丽云, 傅丽娟

(福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

众多研究表明，海藻多糖具有保湿、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等多种生理活性，适当的改性或修饰可以显著影响其相关理化性质与生理活性[1].天然多糖物质，尤其是海藻多糖，糖链上存在大量亲水性基团，如羟基、羧基，能与水分子相互交联形成网状结构[2]，具有优异的吸湿、保湿性能.此外，天然多糖物质通常还具有抗菌、抗氧化等多重功效，并兼具低过敏性与安全性，是具有极大开发潜力的新型天然保湿材料.

本研究测定、对比了石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的硫酸根含量、吸湿保湿性与体外抗氧化活性，探究脱蛋白与降解处理对石莼多糖相关性能的影响，旨在为深入开展石莼多糖及其改性与深加工研究，开发以石莼多糖为原料的具保湿、抗氧化活性的食品、化妆品等提供科学参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

石莼干粉：过80目筛，购于福建海兴保健食品有限公司.

主要试剂：二苯代苦味酰自由基(DPPH·)，购于TCI公司；2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，购于Solarbio公司.无水乙醇、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸、抗坏血酸、冰酸酸、醋酸钠、海藻酸钠、壳聚糖等，均为国产分析纯.

主要仪器设备：DL-5-B离心机(上海安亭科学仪器厂)、UV-1800PC紫外可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、JB-90-2磁力搅拌器(上海天平仪器厂)、Starter 3C型pH计[奥豪斯仪器(上海)有限公司].

在文章后面的描述中，为了表达的简练性，石莼多糖粗品(crudeUlvapolysaccharide)，简称CUP；石莼脱蛋白多糖(deproteinatedUlvapolysaccaride)，简称DUP；石莼多糖粗品降解产物(degradation product of crudeUlvapolysaccharide)，简称DCUP.

1.2 方法

1.2.1 CUP、DUP及DCUP样品的制备 CUP样品的制备：称取一定质量的石莼干粉，加入30倍质量的蒸馏水，调节溶液pH值为4.8；按400 U·g-1石莼干粉添加经活化的纤维素酶，于45 ℃下恒温提取90 min，灭酶，离心，收集上清液，真空浓缩；加入4倍体积的95%乙醇，冷藏过夜，离心，收集乙醇沉淀物，加水复溶，真空浓缩，冷冻干燥，得CUP样品(多糖含量35.62%).

DUP样品的制备：称取一定质量的CUP样品复溶，控制其蛋白浓度为0.70%，调节溶液pH值为10.5；按1 050 U·g-1CUP的量加入活化的碱性蛋白酶，于55 ℃下恒温酶解2 h，灭酶，离心，收集上清液，于7 000 Da透析袋中流水透析48 h，真空浓缩，冷冻干燥，得DUP样品(多糖含量66.97%).

DCUP样品的制备：称取CUP样品溶于预热至90 ℃的0.3 mol·L-1硫酸溶液，调整多糖浓度为0.70%，于90 ℃下恒温反应1 h，冰浴冷却，离心，收集上清液，调节溶液pH至中性，于500 Da透析袋中流水透析48 h，真空浓缩，冷冻干燥，得降解率为(50±1)%的DCUP样品(多糖含量34.41%).其中，降解率(还原糖相对含量)，计算公式如下(1)：

(1)

式中，C为待测样液的总糖含量；C0为待测样液的还原糖初始含量；C1为待测样液降解后的还原糖含量.

1.2.2 CUP、DUP及DCUP的硫酸根含量的测定 (1)硫酸根标准曲线的绘制:采用明胶—氯化钡分光光度法绘制硫酸根标准曲线[3-4]，以0.5%氯化钡—明胶溶液为试验对象，氯化钡—明胶溶液为空白对照，二者360 nm处光密度分别为D2、D1，以D1、D2差值(Y)对硫酸根含量(X)作硫酸基标准曲线，计算求得回归方程：

Y=0.660 6X-0.001 5(R2=0.992 2)

(2)

(2)样品硫酸根含量测定:称取一定量样品，以1 mol·L-1盐酸溶解并配制成1 mg·mL-1样品溶液，100 ℃水浴6 h.反应完毕后，吸取样品盐酸溶液0.2 mL，分别加入3.8 mL 3%三氯乙酸、1.0 mL氯化钡—明胶(试验组)或1.0 mL 0.5%明胶溶液(空白组)，其余操作同(1).

1.2.3 CUP、DUP及DCUP吸湿性、保湿性的测定 (1)吸湿性测定:将饱和硫酸铵溶液置于密闭干燥器的底部，使其形成相对湿度为80%的恒湿环境，放入50 ℃干燥至恒重的CUP、DUP、DCUP及甘油、壳聚糖、海藻酸钠对照样各1.0 g，在室温条件下，于第3、6、9、12、24 h分别称其质量，计算、测定各待测样品的吸湿率.试验平行重复3次，取平均值.

(3)

式中：M1为试验前待测样品的质量(g)；M2为试验后待测样品的质量(g).

(2)保湿性测定:取50 ℃干燥至恒重的CUP、DUP、DCUP及甘油、壳聚糖、海藻酸钠对照样各1.0 g，加入3倍于其质量的蒸馏水，使其充分吸水、溶胀后，放入相对湿度为30%的密闭硅胶—干燥器，在室温条件下，于3、6、9、12、24、36、48 h分别称其质量，计算、测定各待测样品的保湿率.平行重复3次，取其平均值.

(4)

式中：N1为试验前待测样品的水分质量(g)；N2为试验后待测样品的水分质量(g).

(3)最松松密度的测定:参考周洁英[5]的方法，将CUP、DUP、DCUP样品粉末通过漏斗小孔装满量杯，刮平，称重，计算其密度.

(5)

式中：M为待测样品粉体重量(g)；V为量杯体积(cm3).

1.2.4 CUP、DUP及DCUP的体外抗氧化活性的测定 (1)DPPH·清除力的测定:参考周先丽[6]的方法，以0.1 mg·mL-1VC溶液为阳性对照，平行重复3次，结果取平均值.待测样液对DPPH·的清除率的计算公式如下：

(6)

式中，Di为体系于暗处反应30 min后在517 nm处的光密度；D0为蒸馏水代替待测样液加入反应体系时的光密度；Dj为乙醇溶液代替DPPH·醇溶液加入反应体系时的光密度.

(2)总抗氧化能力的测定(对ABTS+·的清除率):参考郑淋[7]、OZGEN[8]的方法，稍作调整：取1.0 mL样品溶液加入3.0 mL ABTS+·工作液，静置30 min后于734 nm测定体系光密度.以0.1 mg·mL-1VC溶液为阳性对照，平行重复3次，结果取平均值.待测样液对ABTS+·的清除率的计算公式如下：

(7)

式中，Di为反应体系反应30 min后在734 nm处的光密度；D0为蒸馏水代替待测样液加入反应体系时的光密度；Dj为醋酸缓冲溶液代替ABTS+·工作液加入反应体系时的光密度.

(3)·OH清除力的测定:采用水杨酸法[9].以0.4 mg·mL-1VC溶液作为阳性对照，平行重复3次，结果取平均值.待测样液对·OH清除率的计算公式如下：

(8)

式中，Di为体系反应30 min后在510 nm处的光密度；D0为蒸馏水代替待测样液加入反应体系中作为空白对照时的光密度；Dj为以1.0 mL蒸馏水代替过氧化氢溶液加入到反应体系中时的光密度.

(9)

式中，v1为待测样液邻苯三酚体系自氧化速率；v2为蒸馏水代替待测样液加入反应体系中的自氧化速率.

(5)对铁氰化钾还原力的测定(FRAP):参考APAK[10]的方法测定反应体系的光密度.以0.1 mg·mL-1VC溶液作为阳性对照，平行重复3次，结果取其平均值.

1.2.5 统计分析 试验数据采用DPS v7.05进行方差分析，各数据间多重比较采用Duncan新复极差法，Microsoft Excel 2007软件绘图.显著性界值以P>0.05为不显著，P<0.05为显著，P<0.01为极显著.

2 结果与分析

2.1 CUP、DUP及DCUP硫酸根含量

经测定，CUP的硫酸根含量为(25.32±0.77)%，极显著高于DUP(12.71±0.26)%(P<0.01)；但与DCUP(24.22±0.46)%的差别不显著(P>0.05).可能是由于本试验采用的CUP样品经碱性蛋白酶脱蛋白处理时，天然多糖残基上的硫酸根基团受到氢氧根的亲核攻击大量脱落[11]，故DUP样品的硫酸根基团含量极显著低于CUP样品(P<0.01)；而CUP样品的降解处理因在稀硫酸作用下进行，对多糖的硫酸根基团不产生明显影响，故DCUP样品的硫酸根基团含量与其未降解的CUP样品无显著差异(P>0.05).

2.2 CUP、DUP及DCUP吸湿性和保湿性

如图1所示，各样品的吸湿率均随时间显著增大(P<0.05)，且3种石莼多糖样品的吸湿率均极显著高于壳聚糖、海藻酸钠对照样(P<0.01).在0～9 h内，各样品吸湿性大小顺序依次为：DUP>甘油>CUP、DCUP>海藻酸钠>壳聚糖；9 h后，各样品吸湿性大小顺序依次为：甘油>DUP>CUP、DCUP>海藻酸钠>壳聚糖.值得注意的是，在试验时间范围内，CUP与DCUP样品的吸湿率无显著差异(P>0.05)；且24 h时，3种多糖样品的吸湿率差异不显著(P>0.05)，分别为(24.90±0.18)%、(24.75±0.01)%、(24.00±1.75)%.

图1 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的吸湿性和保湿性Fig.1 Hygroscopicities and moisturizing capacities of CUP, DUP and DCUP

在空气湿度较低的条件下，材料保持住自身水分的性质称为保湿性.如图1所示，在整个试验过程中，各样品的保湿率均随时间的延长而极显著下降(P<0.01)，保湿性大小顺序依次为：甘油>DCUP>CUP>UDP>海藻酸钠>壳聚糖；且在相同时间内，前三者的保湿率极显著大于后三者(P<0.01)，呈较明显的两极化；在48 h时，前三者的保湿率分别依次为(74.86±0.24)%、(64.77±1.80)%、(60.74±1.47)%，后三者的保湿率分别依次为(17.69±1.06)%、(13.25±0.23)%、(5.24±0.04)%.在相同时间内，DUP样品的保湿率均极显著(P<0.01)低于甘油、CUP、DCUP样品，但仍显著(P<0.05)大于壳聚糖、海藻酸钠.

表1 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的最松松密度Table 1 Bulk density of CUP, DUP and DCUP

由保湿性试验结果可以看出，CUP样品的吸湿性显著(P<0.05)小于DUP样品，可能是由于本试验制备的DUP样品较蓬松，粉体表面积较大，其最松松密度为CUP样品的0.31倍(表1)，与水分子的有效接触面积较大.CUP样品的保湿性极显著(P<0.01)大于DUP，可能是由于其脱蛋白产物DUP的硫酸根含量极显著(P<0.01)低于CUP.前人的研究表明，多糖的硫酸根含量与保湿性呈正相关关系[12].而CUP样品的吸湿性、保湿性与DCUP样品无显著差异(P>0.05)，可能是由于CUP样品经酸降解后虽生成大量亲水性的羟基[13]，但因其结合蛋白在酸降解过程中也被水解，二者综合的结果使得DCUP样品的保湿性及吸湿性与CUP样品无差异.多糖吸湿性强弱虽主要由亲水基团的数量及亲水性强弱决定[14]，但粉体密度、硫酸根及蛋白质含量亦会在一定程度上影响吸湿保湿性.

2.3 CUP、DUP及DCUP的体外抗氧化活性

本试验采用自由基清除率达到50%时的样品浓度(即半抑制浓度，IC50)作为衡量样品清除自由基能力的指标，值越低则表示样品的自由基清除力越强.

2.3.1 对DPPH·的清除力 如图2所示，在本研究的试验浓度范围内，CUP、DUP、DCUP的3种样液与0.1 mg·mL-1VC溶液的DPPH·清除率均随体积分数的增大而极显著增大(P<0.01)，且均在体积分数为100%时达最大值，分别为(60.53±1.03)%、(42.68±1.81)%、(58.49±0.17)%、(68.01±0.92)%；3种样液的DPPH·清除率均显著(P<0.05)低于相同体积分数下的0.1 mg·mL-1VC溶液；在体积分数5%～20%范围内，CUP样液的DPPH·清除率显著(P<0.05)小于DUP样液，而>40%后，CUP样液的DPPH·清除率反而显著大于DUP样液(P<0.05).在5%～80%范围内，CUP样液的DPPH·清除率显著小于DCUP样液(P<0.05)；但>80%后，二者的DPPH·清除率无显著差异(P>0.05).

图2 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的DPPH·清除力Fig.2 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUP on DPPH·

根据表2中的IC50值计算，可知CUP样液的DPPH·清除力是0.1 mg·mL-1VC溶液的0.22倍、DUP样液的1.65倍、DCUP样液的1.66倍.

表2 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物对DPPH·的半抑制浓度1)Table 2 Half maximal inhibitory concentration of CUP, DUP and DCUP on DPPH· scavenging reaction

1)CUP、DUP、DCUP样液浓度为20 mg·mL-1，VC浓度为0.1 mg·mL-1.

2.3.2 对ABTS+·的清除力 如图3所示，在试验浓度范围内，CUP、DUP、DCUP 3种样液对ABTS+·的清除力均随体积分数的增大而极显著增大(P<0.01)，且均在100%时达最大值，分别为(57.52±2.05)%、(47.48±1.77)%、(71.80±2.29)%，3者均极显著小于相同体积分数下的0.1 mg·mL-1VC溶液(P<0.01)；在10%～30%范围内，0.1 mg·mL-1VC溶液对ABTS+·的清除率极显著提高至100%(P<0.01).体积分数>20%后， CUP样液的ABTS+·清除率在各测试点均显著大于DUP样液(P<0.05)，而均显著小于DCUP样液(P<0.05).

图3 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的ABTS+·清除力Fig.3 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUP on ABTS+·

根据表3的IC50值可得，CUP样液的ABTS+·清除力是0.1 mg·mL-1VC溶液的0.08倍、DUP样液的0.07倍、DCUP样液的1.31倍.

表3 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物对ABTS+·的半抑制浓度2)Table 3 Half maximal inhibitory concentration of CUP, DUP and DCUP on ABTS+· scavenging reaction

2)CUP、DUP、DCUP样液浓度为20 mg·mL-1，VC浓度为0.1 mg·mL-1.

2.3.3 对·OH的清除力 如图4所示，在试验浓度范围内，0.4 mg·mL-1VC溶液及CUP、DCUP样液的·OH清除率均随其体积分数的增大而极显著增大(P<0.01)，均在100%时达最大值，分别为(98.78±0.27)%、(59.11±0.86)%、(98.78±0.32)%；且DCUP样液的·OH清除率均极显著高于相同体积分数下的CUP、DUP样液和0.4 mg·mL-1的VC溶液(P<0.01)，但在100%体积分数时与0.4 mg·mL-1的VC溶液的等同；而DUP样液的·OH清除率虽也随其体积分数的增大而增大，但增加幅度并不显著(P>0.05)，当体积分数为100%时，·OH清除率仅为(25.61±0.67)%.根据表4的IC50值可得，CUP样液的·OH清除力是0.4 mg·mL-1的VC溶液的0.64倍、DUP样液的6.54倍、DCUP样液的0.48倍.

图4 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的·OH清除力Fig.4 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUP on·OH

待测样液VCCUPDUPDCUPIC50/%49.28±0.1177.36±0.89505.88±22.0137.31±0.66

3)CUP、DUP、DCUP样液浓度为10 mg·mL-1，VC浓度为0.4 mg·mL-1.

图5 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的清除力Fig.5 Scavenging capacities of CUP, DUP and DCUPt on

表5 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物对的半抑制浓度4)Table 5 Half maximal inhibitory concentration of CUP, DUP and DCUP on scavenging capacity

4)CUP、DUP、DCUP样液浓度为30 mg·mL-1，VC浓度为0.1 mg·mL-1.

2.3.5 对铁氰化钾的还原力 如图6所示，在试验浓度范围内，各待测液对铁氰化钾的光密度(还原力)大小顺序依次为：0.1 mg·mL-1VC溶液>CUP和DCUP样液>DUP样液.在任一体积分数下，0.1 mg·mL-1VC溶液的还原力均极显著高于3种待测样液(P<0.01)，且所有样液的还原力均随其体积分数的提高而极显著增大(P<0.01)，并均在体积分数为100%时达最大值，0.1 mg·mL-1VC及30 mg·mL-1CUP、DUP、DCUP样液的最大还原力分别为(1.237±0.016)、(0.360±0.003)、(0.204±0.038)、(0.329±0.127).在相同体积分数下，CUP样液的还原力极显著(P<0.01)大于DUP样液，而与DCUP样液无显著差异(P>0.05).

图6 石莼多糖及其脱蛋白与降解产物的铁氰化钾还原力Fig.6 Reducing ability of crude Ulva polysacchride and its deproteinated product and degradation product

3 结论

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