香荚兰浸膏精制工艺优化及挥发性成分分析

徐 飞，李 娜，初 众，张彦军,*

（1.中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南 万宁 571533；2.国家重要热带作物工程技术研究中心，海南 万宁 571533；3.黑龙江东方学院食品与环境工程学部，黑龙江 哈尔滨 150066）

香荚兰（Vanilla planifolia Andrews）又名香草兰，素有“食品香料之王”的美誉[1]。香荚兰鲜豆荚没有香味，经发酵后可生成250多种芳香成分，形成的独特香味是人工合成香料无法比拟的[2]。香荚兰豆荚可直接使用，但其芳香成分无法较好地释放到其他产品中[3]，所以经常利用香荚兰浸膏。香荚兰浸膏是经有机溶剂浸提后，再次浓缩所得产物，既保留香荚兰独有风味又不含植物组织。因此，工业上一般采用溶剂浸提制备香荚兰浸膏，将其应用在高级食品、医药、化妆品、保健品等产品中[4]。

目前，国内外对浸膏研究较多，主要集中在浸膏提取工艺优化、浸膏有效成分研究等方面。白凌等[5]通过运用超临界二氧化碳萃取技术萃取藿香梗浸膏，建立了多元二次多项式函数模型，并计算出超临界二氧化碳萃取藿香梗浸膏的最佳工艺条件和相应萃取率。薛茜等[6]建立高效液相色谱同时测定复方甘草胶囊中间体浸膏中苦参碱和氧化苦参碱含量的方法，为制备胶囊提供依据。冯庆华[7]采用分子蒸馏技术对玫瑰浸膏进行精制，在蒸馏温度为80～90 ℃时得到的玫瑰精油香气较好。崔春雨[8]采用有机溶剂法对金银花浸膏中绿原酸进行富集，结果表明乙酸乙酯-正丁醇（3∶2，V/V）对金银花浸膏水溶液中绿原酸富集效果最好。徐飞等[9]利用超声微波协同技术萃取香荚兰净油，并进行工艺优化，结果表明当萃取时间6.91 min、萃取功率253 W、萃取溶剂石油醚-正己烷体积比2.8∶1，净油得率为5.18%。其他研究[10-11]对4 种方法萃取香荚兰进行比较，结果表明用微波法获得香草醛相对含量最高为1.68%，并检测出海南香荚兰豆荚中挥发性成分高达105 种。但目前关于香荚兰浸膏精制的研究鲜见报道。

香荚兰浸膏虽保留大部分风味物质，但其中含有大分子杂质影响产品质量[12]。因此本实验以乙醇常温浸提后减压浓缩制备的香荚兰浸膏为原料，采用有机溶剂萃取法对香荚兰浸膏进行精制，有机溶剂萃取法操作简单，更适合工业化生产[13]，同时采用电子鼻、气相色谱-质谱联用技术与感官评价相结合优化香荚兰浸膏精制工艺，可为香荚兰浸膏工业化精制生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香荚兰粉末 中国热带农业科学院香料饮料研究所；香草醛、香草酸、对羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸标准品美国Sigma公司；甲醇（色谱级） 德国Merck公司；冰乙酸（分析纯） 广州化学试剂厂；乙醇（食用级）、石油醚（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、正丁醇（分析纯） 西陇化工股份有限公司；纯净水 深圳娃哈哈荣泰实业有限公司。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Trace1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo公司；电子鼻分析系统 法国Alpha M.O.S公司；YZN50多功能真空浓缩机 北京东华原医疗设备有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 香荚兰浸膏的制备

准确称取450 g香荚兰粉末（过20 目筛）于多功能真空浓缩机中，加入10 L体积分数80%乙醇溶液于室温浸提40 d，减压回收乙醇至乙醇不再蒸出为止，即得香荚兰浸膏。

1.3.2 萃取有机溶剂类型的选择

取0.5 g浸膏分散于50 mL水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V；下同）、石油醚-正丁醇（1∶1）、乙酸乙酯-正丁醇（1∶1）、石油醚-乙酸乙酯-正丁醇（1∶1∶1）7 种有机溶剂进行萃取。

1.3.3 萃取溶剂体积比与萃取次数的确定

选取最优溶剂种类，设计萃取溶剂体积比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9，萃取次数1、2、3、4、5 次，考察其对香草醛含量的影响。

1.3.4 高效液相色谱检测条件

根据卢少芳等[14]的方法略作修改，色谱柱为ZORBAX XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；进样量5 μL；流速1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温26 ℃；流动相：甲醇-0.2 %冰乙酸体积比20∶80；外标法峰面积定量（标准品质量浓度范围为5～50 mg/L）。

1.3.5 挥发性成分测定

样品制备：将10 mL样品置于旋蒸瓶中，挥干溶剂，并用6 mL二氯甲烷复溶，加入适当的无水硫酸钠除水并过0.45 μm有机滤膜，供气相色谱-质谱分析。

气相色谱条件：根据王海茹等[15]的方法略作修改，色谱柱为TR-5MS毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始温度50 ℃，以5 ℃/min的速率升温至120 ℃，再以5 ℃/min的速率升温到180 ℃，最后以1.5 ℃/min的速率升温到240 ℃；流速1.0 mL/min；载气为高纯度He；进样体积1 μL，进样口温度230 ℃，进样方式为不分流。

质谱条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；扫描范围m/z 30～300。

定性分析：各组分按照气相色谱-质谱谱库（NIST 08，Mainlib，Replib）进行检索，再与文献报道的TR-5MS柱的保留指数[16-18]比对进行定性分析，采用峰面积归一化法对各组分相对含量进行定量分析。

1.3.6 香荚兰浸膏感官评价

表1 感官指标评分标准Table1 Criteria for sensory evaluation

感官评价是建立在人类感官基础上的统计学方法[19]。利用加权评分法进行人为感官评定，邀请10 位从事香荚兰研究的专业人员（5男5女），预先对其培训，利用闻香纸评定香荚兰浸膏（不同有机溶剂萃取的浸膏），各因素权重分数与样品对应因素感官分数相乘后的和作为产品的综合得分。根据初众等[20]的评价方法略作修改，具体感官分析方法参照表1。

1.3.7 电子鼻分析条件

参照Mckellar等[21]电子鼻分析方法略作修改。用0.45 μm滤膜作为气味载体，将滤膜泡在香荚兰浸膏提取液中，静止20 min，置于室温使表面溶剂自然挥干。将处理好的滤膜放入电子鼻分析瓶中压好盖子（每个样品4 个平行），电子鼻孵化温度50 ℃，注射体积1 500 μL，数据采集时间90 s，数据采集延迟时间180 s。

1.4 数据统计

数据采用SPSS 20.0软件分析处理，采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同有机溶剂萃取浸膏电子鼻分析结果

电子鼻分析能得到样品中挥发成分的整体信息，雷达图可直观反应样品在各个传感器的响应值[22]。陈岭等[23]利用电子鼻技术辨识分析茶树花保健鲜啤酒，结果发现智鼻检测系统传感器组成对醇类、醛类、烷烃类、碳氧化合物、氮氧化合物、芳香类化合物等有机物质有很好的选择性，能够检测到气味物质的整体响应特征。从图1可看出，各传感器对不同方法处理的浸膏响应值均不同，说明不同样品在挥发性成分上存在差异。PA/2、T70/2和T30/1传感器对样品中挥发性成分响应值较大。石油醚处理的香荚兰浸膏响应值偏高，可能是由于石油醚是非极性溶剂，极性不同导致提取的挥发性成分也不相同，而其他6 种有机溶剂处理的浸膏与原浸膏的响应值较接近，说明其挥发性成分较为接近。

图1 电子鼻传感器特征响应值雷达图Fig. 1 Radar map of characteristic responses of electronic nose sensors

通过主成分分析方法，能将具有一定相关性的多个指标通过线性变换建立新指标，使这些新指标尽可能保持原有的信息[24]。严超等[25]研究了3 种不同原料发酵枣酒香气主成分分析，发现通过物质载荷图及成分载荷图找到不同枣酒与挥发性成分的相关性，主成分分析可以有效地解释全部挥发性成分的信息。对8 种不同方法处理的样品进行主成分分析，每个样品4 组平行数据，由图2可知，每一组数据都可以形成较好的群落，表明样品重复性较好。第1主成分与第2主成分累计方差贡献率为99.97%，包含香荚兰浸膏挥发性成分大部分的信息量，较好地反映出香荚兰浸膏的整体香气。通过乙酸乙酯-正丁醇（1∶1，V/V）、石油醚-乙酸乙酯-正丁醇（1∶1∶1，V/V）混合溶剂、正丁醇溶剂处理后的浸膏与对照组整体香气很接近，均位于图2中的第1象限，说明可保留较大部分原浸膏的香气。通过乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶剂处理的浸膏与对照组信息散点图相距较远，而通过石油醚处理后与对照组信息散点图相距很远，表明通过石油醚处理过后的浸膏已失去原有香气。这可能是由于香荚兰浸膏为极性溶剂提取，而石油醚的极性较小，导致石油醚提取效果不好。

图2 不同香荚兰浸膏香气的主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of aroma components of different vanilla extracts

2.2 不同有机溶剂萃取浸膏感官评价结果

通过感官评定对7 种溶剂处理过后的浸膏（香气、色泽、性状）进行评价。权重的确定：权重是根据3 个因素对香荚兰浸膏整体评价的重要程度而确定的，综合3 个因素对有机溶剂处理后的浸膏进行打分，10 位评委对3 个因素权重打分如表2所示。加权评分：10 位评委以原浸膏为对照，对7 种不同溶剂处理后的香荚兰浸膏，从香气、色泽、性状3 方面进行评分。样品总得分为各因素所占比重乘以得分的和，再相加得到。

表2 权重打分结果Table2 Weighted scores

表3 不同溶剂处理香荚兰浸膏评定结果Table3 Sensory evaluation of vanilla extract refined with different solvents

由表3可知，香荚兰浸膏总体评分结果为乙酸乙酯-正丁醇（1∶1，V/V）（84.85）＞石油醚-乙酸乙酯-正丁醇（1∶1∶1，V/V）（83.00）＞正丁醇（81.45）＞石油醚-正丁醇（1∶1，V/V）（80.80）＞乙酸乙酯（80.00）＞石油醚-乙酸乙酯（1∶1，V/V）（76.60）＞石油醚（73.90）。从香气、色泽、性状3 个因素综合评价最高分数为乙酸乙酯-正丁醇（1∶1，V/V）处理浸膏，表明它与原浸膏的整体香气、性状最为接近。

电子鼻传感器数量有限，与人类嗅觉神经元细胞数量相差巨大，导致不能捕获全部香气，而感官评价是食品开发中常用的方法之一[26]，但感官评定的结果受人为影响比较大。所以将电子鼻技术与感官评定相结合，可以更好的评价香荚兰浸膏的整体香气。电子鼻和感官评定综合结果表明，乙酸乙酯-正丁醇（1∶1，V/V）处理后香荚兰浸膏性状更好，香气更容易被人接受。

2.3 精制浸膏萃取溶剂体积比及萃取次数优化结果

2.3.1 精制浸膏萃取溶剂体积比优化结果

在上述实验结果的基础上，选用乙酸乙酯-正丁醇（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9，V/V）9 种比例对乙酸乙酯与正丁醇的混合比例进行优化，通过液相色谱仪对香荚兰浸膏中4 种主要成分[27]（香草醛、香草酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸）含量进行测定，比较9 种不同混合比例对香荚兰浸膏的萃取效果。从图3可以看出，当乙酸乙酯-正丁醇混合比例为5∶5（V/V）时，香草酸质量分数达到最大值为1.03%，比原浸膏增加0.42%。香草醛、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸含量随着溶剂中正丁醇比例的增加，含量也逐渐增加，在乙酸乙酯-正丁醇3∶7（V/V）时质量分数达到最大值，分别为9.48%、0.39%、0.15%，比原浸膏增加0.58%、0.01%、0.01%。由于溶剂相似相溶原理，因为每种物质的极性不同，溶质与溶剂极性相近，两者可以很好地结合溶解[28]。香草醛在香荚兰整体香气贡献率高达1/3，综合考虑选用乙酸乙酯-正丁醇（3∶7，V/V）作为萃取溶剂。

图3 主要风味物质含量Fig. 3 Effect of solvent composition on the contents of major flavor substances

2.3.2 精制浸膏萃取次数优化结果

萃取次数为萃取过程中较为重要的因素之一，考察萃取次数对乙酸乙酯-正丁醇（3∶7，V/V）混合溶剂萃取浸膏的萃取效果。由表4可知，以浸膏中香草醛质量分数为指标，随着萃取次数的增加，香草醛含量呈现先升高后平稳趋势，萃取3 次时浸膏中香草醛质量分数达到最大值为9.83%，可较完全将香荚兰浸膏中香草醛萃取出来，综合考虑萃取率结果及经济节约，最终确定萃取溶剂为乙酸乙酯-正丁醇（3∶7，V/V）、萃取3 次萃取效果较好，香草醛含量较高。

表4 萃取次数的选择Table4 Effect of number of extractions on vanillin retention

2.4 浸膏精制前后主要风味物质比较分析

由表5可知，对香荚兰浸膏、精制浸膏进行气相色谱-质谱联机分析，共检测出75 种挥发性成分，原浸膏、精制浸膏中分别检出56、54 种。利用面积归一法对其进行定量分析，可知香草醛是香荚兰中最主要的香气成分，浸膏精制前后香草醛相对含量分别为27.83%、35.50%。香荚兰浸膏中有较多的芳香族、醛类、醇类、酯类等化合物，含量较高的主要物质有愈创木酚、5-羟甲基糠醛、4-甲氧基苯酚、香草酸、亚油酸甲酯，这几种物质均在精制浸膏中可检测到，原浸膏只有其中的4 种。香荚兰中除含量较高的挥发性成分外，微量挥发性成分也为香荚兰的整体香气贡献较大，Toth等[29]认为苯乙醇、2-乙酰基吡咯、4-甲基苯酚、4-甲氧基甲基苯酚对香荚兰的整体香气也有较大的贡献率。这些物质含量虽然较少但在精制浸膏中均能检测到，说明精制后浸膏既能保留原浸膏的原有香气，还能起到改善香气的作用，各类化合物的种类及相对含量见表6。

表5 挥发性成分分析Table5 Volatile aroma composition of crude and refined vanilla extract

续表5

表6 各类化合物的种类及相对含量Table6 Relative contents of different compound classes in crude and refined vanilla

从表6可以看出，香荚兰浸膏中挥发性物质种类较多，且芳香族、酯类、酸类占总成分比重达90%以上。浸膏精制后芳香族相对含量从原来的35.58%增加到51.00%，酯类化合物相对含量从41.90%减少到29.59%，而烷烃类化合物相对含量从4.42%递减到0.78%。浸膏精制后芳香族的种类也从原来的19 种增加到23 种，酯类化合物从原来的18 种减少到12 种，烷烃化合物、醇类、酸、酮类都有一定程度的减少。而醛类化合物从相对含量或者种类上变化不大。这可能是由于通过有机溶剂纯化精制后去除了部分对香荚兰香气贡献不大、不易挥发的大分子烷烃类化合物，使得芳香族类化合物明显增加；酯类化合物发生减少，这可能是由于部分由高级脂肪酸和高级醇形成的酯类是蜡质的主要成分，蜡质成分在乙酸乙酯与正丁醇中溶解效果不如乙醇，导致浸膏在乙酸乙酯和正丁醇作为有机溶剂纯化分离精制时可能残留在有机溶剂与水交界面，未完全分离到有机溶剂中影响酯类物质减少。而醛类物质种类和含量上变化不大，醛类物质如香草醛、对甲氧基苯甲醛等是香荚兰浸膏中独特的香味物质，在香荚兰浸膏香味中占有重要地位[30]。这说明精制后的浸膏仍保留原浸膏中的主要香味物质。

3 结 论

通过电子鼻与感官评价分析相结合，对7 种有机溶剂精制香荚兰浸膏的效果进行对比，结果表明，乙酸乙酯-正丁醇萃取效果最佳，与原浸膏香气最为接近，色泽变浅；当乙酸乙酯-正丁醇体积比3∶7、萃取3 次时，萃取效果最佳，香荚兰浸膏中香草醛质量分数达到最大值为9.83%。

对香荚兰浸膏精制前后挥发性成分进行对比，结果表明，香荚兰浸膏精制前后挥发性物质种类有所不同，精制后的浸膏大部分保留了原浸膏中的香味物质如（醛、醇、酯等类化合物），而减少了不挥发性对香气没有贡献的大分子类物质如烷烃等。

采用电子鼻结合人为感官、气相色谱-质谱联用技术优化香荚兰浸膏精制工艺，操作简单、可行，可为香荚兰浸膏精制提供参考。

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