月经血鉴别方法的法医学研究进展

李 军 宫春妮 巢 雯

（中国刑事警察学院法医学系 辽宁 沈阳 110035）

1 引言

在法医学实践中，生物组织来源往往可提示案件发生的过程及重建现场，例如死者指甲检出非本人人体组织成分，推测死者生前曾与他人发生过肢体接触，从而给侦查工作提供线索。因此，有时需要对生物检材的组织来源进行确认，月经血是其中一种重要检材。例如在伤害案中，女性受害者称因受暴力攻击出现血尿，在这种情况下，需要确定尿液中的血细胞来源是否存在月经血污染，并结合其他临床检验，审慎评定伤情。月经血是女性的子宫内膜发生周期性脱落伴随的出血[1]，与正常的外周血相比，月经血在组成成分上有很大不同。目前实践中对月经血的检测主要采用不同方法，针对其中的特异性成分进行鉴别。

2 经典鉴定方法

目前，常用且成熟的方法可以分为两类：一类是细胞形态学观察法；另一类是特异生物大分子检测法。

2.1 细胞形态学观察法

月经血是由血液和一些脱落的子宫内膜、阴道分泌物等组成的混合物。细胞形态学观察法是指经过特殊染色，在显微镜下找到子宫内膜细胞、阴道或宫颈鳞状上皮细胞[2]。这种方法存在一定的不足之处：一方面，女性生殖器官出血也可见这些细胞，形态学观察法仅能确定该血液来自于女性生殖器，而不能断定其为月经血；另一方面，该方法需要大量新鲜的血液涂片才有可能观察到上述细胞，实际案件中的血痕量难以满足观察要求，故实际应用效果不佳。

2.2 特异性生物大分子检测法

月经血之所以不易凝固是因为其中的纤维蛋白被纤溶酶降解，已有研究者对月经血中的纤溶蛋白降解产物进行检验。19世纪60、70年代，Kamimura[3]将纤维蛋白加入到血痕提取液中，再用纸电泳检查其分解产物。Whitehead[4]通过变性纤维蛋白混浊试验或抗人纤维蛋白原沉淀试验，用免疫电泳方法区分月经血和其他部位出血。这些方法虽然在丧失溶解纤维蛋白能力的情况下仍可进行鉴定，但是无法将月经血与分娩血、流产血、流动的尸血，以及某些患有与纤维蛋白溶解相关疾病的血液相区别。Asano[5]对乳酸脱氢酶（LDH）的同工酶进行测定，其原理是电泳时5种LDH分子的迁移程度不同，形成5个明显的区带，正常血中LDH同工酶组成比例接近于其在红细胞中的比例，即LDH4、LDH5含量几乎为0，而在月经血中LDH4、LDH5含量增多，两者总和尤为明显，据此形成LDH同工酶图谱，可以区分月经血与其他体液成分。随后Divall[6]，Miyaishi[7]等对LDH在月经血鉴别中的作用做进一步研究，发现LDH无法用于区分经血与外周血、阴道分泌物的混合血样本。目前，随着犯罪技术的提高，现场留下的血迹逐渐变得量小体微，取得的检材难以进行上述检验；另外，由于以上检验方法和技术的灵敏度、专一性等难以适应现在的鉴定要求，该方法逐渐被新兴检测方法所取代。

3 新兴鉴定方法

3.1 基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）鉴定法

随着研究技术的发展进步，法医学者开始着眼寻找新的检测标志物。经研究证实，多种MMP分子参与月经周期的相关过程，因此，MMP成为热门研究对象。经学者研究发现，MMPs中的部分成员可以作为月经血的特异性标记使用，其中同时符合灵敏度高、专一性好的是MMP7和MMP11。MMP7主要与子宫内膜的增生重建过程有关[8]。MMP11也是以上行为的重要参与执行者，尤其在增生期、分泌晚期、月经期子宫内膜中的活跃度高[9-10]。MMP7、MMP11作为月经周期的重要参与者，已被用来进行月经血的鉴别。

3.2 RNA分析技术在月经血鉴别中的应用

经典鉴别方法局限性较大，法医学者开始探索新的检验技术。RNA是细胞内DNA与蛋白质的连接桥梁。RNA主要分为4种，目前将其用于法医学研究较深入的是mRNA（messenger RNA）和miRNA（micro-RNA）。由于mRNA具有表达特异性，因此，用于检测RNA的种类可以回溯其组织来源[11]。逆转录PCR（RT-PCR）法、实时定量PCR（qRTPCR）法成为目前检测月经血中特异性的mRNA、miRNA的主流技术，已取得的实验成果颇多。

3.2.1 mRNA检测技术

mRNA在干燥载体上有较高的稳定性，可以与DNA从同一样本中同时提取，而且在一次多重反应中能够检测多种体液成分，是良好的检测标志物。Juusola和Ballantyne[12]开始致力于寻找特异性基因以定位体液和组织来源的方法。2005年Juusola和Ballantyne[13]设计实验体系，得到了一种鉴别体液的复合RT-PCR方法，体系中包括八个特异性基因（SPTB、PBGD、STATH、HTN3、PRM1、PRM2、HBD1和MUC4），用来鉴别血液、唾液、精液、阴道分泌物。该体系可以进行混合斑的检测，检测量可低至200pg总RNA模板。2007年Juusola和Ballantyne[14]在先前检测体系基础上进行重新设计，ALAS2取代PBGD，MMP7和MMP10成为月经血的检测标记被纳入体系中，初次将mRNA检测应用于月经血的鉴别。同年Bauer[15]经过实验证实mRNA检测未检出MMP7的体液可以确定不是月经血。Haas[16-18]在先前mRNA标记体系的基础上，重新选择标记物，包括用来鉴定月经血的MMP7和MMP11在内的11种标记物，构建复合RT-PCR体系和qRTPCR体系来鉴定月经血等5种体液来源，这两个复合体系均显示出高特异性和高灵敏度。另外，对于MMP7、MMP11的灵敏度和专一性，学者进行过分析讨论，Haas、Lindenbergh、Xu Y[19-20]等研究者认为MMP7的灵敏度高于MMP11，而MMP11的专一性更高；相反，Richard、JaKubowska[21-22]等认为，MMP11是判定月经血更佳的指标。Haas[23]进一步研究，尝试在复合体系中加入MSX1、LEFTY2和SFRP4三个新的检测标记，增加了检测体系的可信度。

3.2.2 miRNA检测技术

miRNAs属于一类具有内源调控作用的非编码小RNA，参与多途径的调控过程，miRNAs的表达具有组织特异性。

Hanson[24]于2009年首次发表了关于miRNA用于组织来源鉴别的研究成果。经过试验探索，运从月经血等5种人体体液中选择了452种人体miRNAs，最终确定9种不同miRNAs构成复合检测体系：miR451、miR16、miR135b、miR10b、miR658、miR205、miR124a、miR372和miR412，其中miR451和miR412被认为是具有鉴别月经血价值的miRNA，该方法检测阈值可达到50pg，成为miRNA检测月经血的开端。2013年，Zubakov[25]利用TaqMan的RT-PCR技术和Northern印迹技术从718个miRNA中选取9个研究它们的表达情况，检测灵敏度达到0.1pg总RNA量，经验证，实验所选取的miR185*和miR144特异性不高，不建议将其用于月经血的鉴别。同年，Wang[26]进行进一步研究，利用qPCR测定法（TaqMan1 Array Human MicroRNA Cards）筛选754个miRNA进行检测，研究结果显示miR214在月经血的鉴定中特异性较好。2014年，Hanson[27]在先前的实验基础上进行深入探索，新增加746个miRNA，测定总miRNA数目达到1198个，构建二元逻辑回归模型得出关于月经血的定量统计模型。二维散点图研究以qPCR为基础测量ΔCt值（选择管家基因miR940作为标准参考，设定ΔCt参数，ΔCt = Ct（MBmiRNA-CtmiR940），ΔCt值在二维散点图上的聚集状况反映不同样本的种类）。经过检验测算确定了miR144-5p、miR144-3p和miR185-5p在月经血鉴定中具有高度专一性和敏感度，并表明主要影响因素miR185和三因素（miR144-5p、miR144-3p、miR185-5p）相互作用综合分析对预测月经血十分有效。二元逻辑回归模型增加了鉴别体液组织来源的准确度，效果优于二维散点图。Li[28]在2015年的研究中确定miR141-3p可以用于月经血的鉴定。可以看到，基于技术平台和统计学分析方法的差异，众多学者的研究结果并不一致，可信度不高。目前为止，对miRNA用于月经血鉴别的研究仍在探索阶段，仍需要进行更多深入的实验研究。

3.3 其他方法

除了主流的RNA检测技术外，对于月经血的鉴别仍有许多学者进行了各种实验研究。

3.3.1 免疫化学方法

有研究表明，月经血D-二聚体是外周血中的2000倍[29]，因此，Baker[30]提出检测月经血中的D-二聚体的浓度以鉴定月经血与外周血。我国研究者对MMP11的研究，还有其他方法：姚亚楠[31]运用链霉卵白素-碱性磷酸酶免疫组化法检测MMP11；章雅清[32]运用免疫印迹法转膜、增强化学发光法显色检测 MMP11，两种方法阳性率均较高。Gray[33]使用免疫细胞化学染色法分析细胞或膜结合的抗原，通过间接ELISA法检测可溶性抗原，结果在月经血中检测到MMP14，而外周血中未检见。免疫化学方法虽然在操作上繁琐，但已经较为成熟，可为月经血鉴别提供参考。

3.3.2 DNA甲基化方法

Song[34]等学者经过大量研究证实，组织特异性差异甲基化区（tDMRs）存在于多种哺乳动物的不同组织中，有学者开始研究DNA甲基化标记能否用来进行月经血的鉴别检测。但由于月经血是含有外周血、脱落的子宫内膜组织、阴道分泌物，以及阴道菌群等的混合物，各种因素对甲基化干扰较大，因此，通过DNA甲基化进行月经血鉴别比较困难。2016年Forat[35]首次报道了位于SLC26A10基因上的cg09696411可以用来鉴别月经血。同年Hwan Young Lee[36]使用Human Methylation 450 Bead Chip array确定位于SLC26A10基因上的cg09696411和cg18069290是良好的鉴定月经血的甲基化标记，其中cg09696411在月经周期的第2天含量最高。但同时也指出该标记的特异性程度与月经周期时间段和月经血收集方法有关。已知DNA甲基化程度与年龄有关，因此，甲基化能否有效的鉴别月经血，还需要排除其他干扰因素，设计更多的实验进行探索。

3.3.3 高分辨率熔解法

高分辨率熔解法（High Resolution Melt analysis，HRM）利用特定染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，不同形状熔解曲线将PCR产物中存在的差异直观地展示出来，从而区分不同产物。Hanson[37]使用HRM技术，构建多重检测体系对体液来源进行鉴别，其中用于鉴别月经血的标记是MMP10，得到MMP10的Tm值为81.9℃。相比RNA分析法，HRM具有分析速度快的优势，可为月经血的鉴别提供参考。

3.3.4 光谱分析法

由于不同物质分子的不同振动能级，因此，不同物质的拉曼光谱具有特异性，可以反映分物质的组成信息[38]。2012年，Sikirzhytskaya[39]运用拉曼光谱分析法，使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和支持向量机判别分析（SVM-DA）建立判别模型，该模型对月经血与外周血鉴别的灵敏度和选择性可达98%，消除非特定光谱数据的干扰能够将识别率提高到100%。

2015年高野[40]利用紫外可见分光光度计法建立了可以快速无损定性不同种类、不同情况的血迹的方法，该方法根据检测得到特定的波峰波谷可以确定不同血迹的种类。实验中检测得到月经血的波峰为560nm、波谷为575nm，具有特异性。

衰减全反射傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）逐渐开始被学者用于液体斑迹鉴定的研究。ATR-FTIR基于光内反射原理，收集样品表面的红外光反射信号来反映样品表层的结构信息[41]。2017年Quinn[42]利用ATR-FTIR技术检测到在1039cm-1处月经血与外周血发生峰分离，这与月经期女性体内游离的磷酸释放有关。ATR-FTIR具有非破坏性、制样简单的优点。

以上光谱法在测定月经血上具有不破坏检材的优点，但是现场检材复杂程度高，光谱能否发挥功效仍有待进一步验证。

4 展望

部分月经血检测方法已进入应用阶段，但多数检测方法仍处在研究阶段，在法医实践中仍缺乏灵敏快速的检测方法。因此，我们仍需要对以上方法进行优化和探索，同时开展新的研究，以求获得一种方便、高效、快速，可用于现场即时检验的方法。

经典鉴定方法为月经血检测的研究奠定了基础，但其所采用的方法繁琐、灵敏度低，因而难以适应现今的研究和应用。新兴鉴定方法采用新的标志物MMP及新的鉴定技术，极大提高了月经血鉴定的准确性。其中研究较为深入的是RNA检测技术，选取MMP7、MMP10、MMP11作为检测标志物均得到可靠的结果，可为法医实践提供参考。此外免疫化学方法已较为成熟，但操作较繁琐；DNA甲基化方法尚需更多实验排除其他因素干扰；高分辨率熔解法和光谱分析法在实验室分析得到的结果特异性较好，但无法用于现场快速检验。

随着技术的提升与研究的深入，相信月经血在法医现场检测应用方面的研究能够不断取得新的进展，例如根据免疫化学方法，设计金标试纸条对现场疑似月经血的血迹进行快速检测，这将有助于提高侦查破案速度，并在一定程度上推动法医实践的发展。

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