桑枝中三种氨基酸成分的薄层鉴别

李晓艳， 努尔麦麦提·阿卜力孜， 孙 莲

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

桑枝(RamulusMori) 是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥嫩枝，其药用价值极高，具有祛风活络、通利关节、燥湿利水之功效[1]。研究表明桑枝中主要含有多糖、生物碱、黄酮和氨基酸等成分[2-10]，具有良好的降血糖、降血脂、抗菌消炎、提高机体免疫力等生物活性和生理活性作用，主要用于治疗糖尿病、高血脂等疾病[11-14]。本研究采用薄层层析法(TLC)对桑枝中氨基酸成分进行定性分离鉴别，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器Linomat-5 型半自动点样仪(德国CAMAG公司)，REPROSTAR-3型薄层色谱数码成像系统(德国CAMAG公司)，AL204型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，KQ-700DE型超声波提取仪(昆山市超声仪器有限公司)，TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，SHB-Ш 型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，DHG-9245A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.2试剂硅胶G板、高效硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板(青岛海洋化工厂)，聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)，精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸对照品(北京博奥拓达科技有限公司)，茚三酮(天津永晟精细化工有限公司)，正丁醇、冰醋酸(天津市富宇精细化工有限公司)。

1.3药材桑枝样品采自新疆10个不同地区(喀什市、和田市、库尔勒市、阿克苏市、和田县、疏勒县、沙雅县、莎车县、洛浦县、库尔勒恰尔巴格乡)，经新疆医科大学药学院天然药物教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为桑科植物桑(MorusalbaL.)的枝。采集的新鲜桑枝切成小段，粉碎后在60～70℃烘干，然后过40目筛，备用。

2 方法与结果

2.1供试品溶液的制备称取干燥的桑枝粉末2.0 g，置于锥形瓶中，加50 mL蒸馏水，超声提取30 min，抽滤, 将滤液蒸馏浓缩，10 000 r/min离心10 min, 蒸馏水定容至10 mL,即得。

2.2对照品溶液的制备

2.2.1 氨基酸对照品溶液的制备 称取“1.2”项下所述13种氨基酸对照品各100 mg，分别用蒸馏水溶解定容至100 mL，制得浓度为1.0 mg/mL的13种氨基酸对照品溶液。

2.2.2 混合氨基酸对照品溶液的制备 称取缬氨酸、精氨酸，苏氨酸对照品各100 mg，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，即得。

2.3薄层色谱条件的考察

2.3.1 展开系统的选择 将2 μL的混合氨基酸对照品溶液和3 μL的供试品溶液，在同一硅胶G薄层板上点样，分别用0.2%茚三酮的正丁醇-冰醋酸-水 (4∶2.2∶3)、正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5 )、正丁醇-冰醋酸-水(4∶3∶1),正丁醇-冰醋酸-水(4∶2.2∶1) ，正丁醇-冰醋酸-水(6∶2.2∶1) 5种不同展开系统展开，取出晾干后，105 ℃加热显色至斑点清晰，根据斑点的分离及拖尾情况确定正丁醇-冰醋酸-水(6∶2.2∶1)为最佳展开系统，见图1。

1:混合对照品溶液;2:样品溶液;A:正丁醇- 冰醋酸-水(4∶1 ∶5);B:正丁醇- 冰醋酸-水 (6∶2.2∶1);C:正丁醇- 冰醋酸-水(4∶2.2∶1);D:正丁醇-冰醋酸-水 (4∶3∶1);E:正醇-冰醋酸- 水 (4∶2.2∶3)

图1不同展开系统的桑枝TLC图

2.3.2 点样量的选择 分别将混合氨基酸对照品溶液和供试品溶液1、2、3、4、5、6 μL，点于同一硅胶G薄层板上，用含0.2%茚三酮的正丁醇-冰醋酸-水(6∶2.2∶1)为展开系统展开，取出晾干后，105℃加热显色至斑点清晰。由斑点的分离度情况可知，混合氨基酸对照品溶液和供试品溶液的最佳点样量分别是2 μL和3 μL，见图2。

(1～6依次为：对照品溶液1、2、3、4、5、6 μL，7～12依次为：供试品溶液1、2、3、4、5、6 μL)

图2不同点样量的桑枝薄层色谱图

2.3.3不同薄层板的考察将供试品溶液3 μL 及混合对照品溶液2 μL点于不同的薄层板：硅胶G板、高效硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、聚酰胺薄膜，并分别用0.2%茚三酮的正丁醇-冰醋酸-水(6∶2.2∶1)展开剂展开，取出晾干，105℃加热显色至斑点清晰，由斑点的拖尾情况和分离度情况可知，硅胶G板上的效果最好，见图3。

2.4氨基酸的定性分析分别将2 μL的13种对照品溶液和3 μL的供试品溶液，点于同一硅胶G薄层板上，用含0.2%茚三酮的正丁醇-冰醋酸-水(6∶2.2∶1) 展开剂展开，取出晾干，105℃加热显色至斑点清晰，桑枝提取物出现6个斑点，其中3个斑点的颜色和位置分别与精氨酸、缬氨酸和苏氨酸对照品的一致，且具有相同的Rf值(Rf1=0.16，Rf3,=0.57，Rf4=0.43)，见图4。

(A:硅胶G板;B:高效G板;C:H板; D:GF254板; E:聚酰胺薄膜; 1:对照品;2:样品)

图3不同薄层板的桑枝TLC图

(0:样品;1:精氨酸;2:赖氨酸;3:缬氨酸;4:苏氨酸;5:苯丙氨酸;6:色氨酸;7:谷氨酸;8:天冬氨酸;9:胱氨酸;10:甘氨酸;11:丝氨酸;12:酪氨酸;13:亮氨酸)

图4桑枝中氨基酸的TLC图

2.5新疆10个不同产地桑枝中氨基酸的薄层鉴别分别吸取不同产地的桑枝供试品溶液3 μL和混合氨基酸对照品溶液2 μL，在同一硅胶G薄层板上点样，用0.2%茚三酮的正丁醇-冰醋酸-水 ( 6∶2.2∶1) 展开剂展开，取出晾干，105℃加热显色至斑点清晰，在新疆10个不同产地的桑枝供试品的薄层图谱中，在与对照品精氨酸、缬氨酸、苏氨酸的相同位置上，均能显现颜色相同的斑点，见图5。

(1:喀什市;2:和田市;3:库尔勒市;4:阿克苏市;5:和田县;6:疏勒县;7:沙雅县;8:莎车县;9:洛浦县;10:库尔勒恰尔巴格乡)

图5不同产地桑枝的TLC图

3 讨论

本研究对不同的展开剂、点样量及薄层板对桑枝中精氨酸、苏氨酸和缬氨酸的TLC分离的影响进行研究，选择出最佳薄层分离条件为：以正丁醇-冰乙酸-水(6∶2.2∶1)为展开系统，茚三酮为显色剂，混合氨基酸对照品溶液和供试品溶液的点样量分别是2 μL和3 μL，于硅胶G薄层板上分离。结果对照品与样品Rf值相同，斑点清晰，分离度高。此外薄层色谱图中还有3个斑点不能确定其归属，还需进一步研究。试验中对薄层色谱的显色程序进行了优化，直接将茚三酮显色剂加入到展开剂中，展开完毕后，加热显色。该方法省去了喷雾显色的程序，具有操作简单，薄层面光滑完整，氨基酸斑点显色均匀，Rf值不变等优点。

[1] 国务院药典委员会.中华人民共和国药典[M]. 北京：北京工业出版社，2010：280.

[2] 洪德志,时连根.桑枝多糖对糖尿病模型小鼠的降血糖作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2012,26(6):806-809.

[3] 郭福团,许雄伟,潘建峰,等.桑枝多糖对糖尿病肾病大鼠肾脏组织抗氧化作用的影响[J].中国医院药学杂志, 2016,36(23):2058-2061.

[4] 孙莲，孟磊，阿布都许库尔·吐尔逊.气相色谱法测定新疆桑枝多糖中单糖组成及含量[J].安徽农业科学,2014,42(19):6207-6208.

[5] 刘超,史正琴,向伟,等.桑枝1-脱氧野尻霉素的提取及其含量与α-糖苷酶抑制活性的相关性分析[J].林业科学,2015,51(2):112-120.

[6] 张波,李学刚,罗旭梅,等.桑枝提取物对α-葡萄糖苷酶活性及餐后血糖的影响[J].时珍国医国药,2014,25(6):1325-1327.

[7] 孙莲,杜申道,李晓艳,等.桑枝中槲皮素和绿原酸的薄层色谱鉴别及抗氧化活性筛选[J].国际药学研究杂志,2016, 43(3):548-551.

[8] 姜乃珍,薄铭,吴志平,等.中药桑枝化学成分及药理活性研究进展[J].江苏蚕业,2006,28(2):4-7.

[9] 李晓艳,杜申道,孙莲.桑枝中γ-氨基丁酸的鉴别与含量测定[J].国际药学研究杂志,2016, 43(5):994-997.

[10] 甄攀,倪刚,郭伟强,等.川桑(Morus notabilis)枝条的药用化学成分分离鉴定[J].蚕业科学,2016,42(2):307-312.

[11] 牛凤菊,周祉延.桑枝降血糖的活性部位研究[J].世界中西医结合杂志,2015,10(9):1219- 1221.

[12] 吴娱明,邹宇晓,廖森泰,等.桑枝提取物对实验高血脂症小鼠的降血脂作用初步研究[J].2005, 31(3):348-350.

[13] 章丹丹,凌摇霜,张洪平,等.桑枝总黄酮体外抗炎活性及机制研究[J].时珍国医国药, 2010,21(11):2787-2890.

[14] 邬灏,卢笑丛,王有为.桑枝多糖分离纯化及其免疫作用的初步研究[J].武汉植物学研究,2005,23(1):81-84.