浅谈模拟痰标本应用于抗酸染色法

2018-02-02王娜

卫生职业教育 2018年3期

王娜

（北京卫生职业学院，北京100053）

结核分枝杆菌（M.tuberculosis）俗称结核杆菌，是结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺脏最多见。据统计，全世界有1/3的人口感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新增病例，至少有300万人死于肺结核，肺结核已成为医学检验专业重要的教学内容[1]。抗酸染色法是检验结核分枝杆菌的常规方法，该法于1882年由埃利F Ehrlich首创，经F·齐尔改进。其中最具代表性的为齐—尼氏染色法和齐尔—加贝特（Ziehl-Gabbet）染色法[2]。目前，抗酸染色法已被广泛应用于临床，结核分枝杆菌的抗酸染色法是医学检验专业学生必学、必会的内容。

1 研究原因

结核分枝杆菌传染性极强，传播途径主要有呼吸道、消化道、皮肤和子宫。排菌期肺结核病人的痰液干燥后，细菌随尘土飞扬，被他人吸入而引起感染。人体吸入含有结核分枝杆菌的飞沫是否患病主要与吸入细菌的数量、毒力、自身抵抗力等多种因素有关，可累及全身多个器官、系统，最常见的部位是肺脏（占80%～90%)，也可累及肝、肾、脑、淋巴结等器官。由于实验室人员密度大、学生生物安全意识淡薄、自我保护能力差等，增加了实验教学的生物安全隐患。加之病人痰标本中结核分枝杆菌含量不定，甚至还会有阴性标本，所以实验课上常会出现检出率低的情况，无法达到预期教学效果。《传染病防治法》《医院感染管理办法》《医疗机构管理条例》《突发公共卫生事件应急条例》等法律法规规定，医院对临床标本应严格管理，不得外漏，故学校获取痰标本的难度非常大。

2 模拟痰标本抗酸染色法

为达到既让学生学到知识，又保证师生安全的目的，我们经过多次实验，找到利用模拟痰标本进行抗酸染色教学的方法，具体如下。

2.1 抗酸染色的原理

结核分枝杆菌的细胞壁含有大量脂质（主要是分枝菌酸），它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，需要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐—尼氏染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。再加入碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质则为蓝色。

2.2 模拟痰标本片的制备

2.2.1 材料（1）取10 ml正常人痰液，加入40 ml生理盐水,混匀。（2）卡介苗1支（0.75 mg/ml）。

2.2.2 模拟痰标本制备方法用注射器将卡介苗吸出，注入50 ml正常人痰液中，制备成痰悬液，采用高压蒸汽灭菌法（103.4 kpa，121.3℃）灭菌 30 min。

2.2.3 涂片所需物品：灭菌滴管、载玻片。涂片方法：（1）在干净的载玻片上用玻璃蜡笔做好标记，以便分清正反面。（2）用灭菌滴管取痰悬液1滴，置于载玻片中央，制成1.0 cm×1.0 cm大小的均匀薄涂片。（3）将涂片置于通风干燥处，自然干燥即可。（4）火焰固定痰涂片。

2.3 抗酸染色步骤

2.3.1 初染将已固定的痰涂片置于染色架上或用染色夹子夹住，滴加石炭酸复红染液2～3滴，在火焰上方徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽时移开，若染液蒸发减少，及时添加，加热3～5 min，待标本冷却后用水冲洗。

2.3.2 脱色以3%盐酸酒精脱色，直至涂片已无红色染液脱下为止（不可超过10min），用水冲洗。

2.3.3 复染滴加碱性美兰溶液盖满痰膜，复染1 min，之后用水冲洗，再用吸水纸吸干。

2.4 镜检

在淡蓝色背景下，抗酸杆菌（结核分枝杆菌）呈红色，非抗酸菌及细胞等均呈蓝色，镜检结果见表1。

表1 镜检结果

3 模拟痰标本与真正痰标本的阳性检出率比较

我校于2015年第二学期对模拟痰标本在抗酸染色实验教学中的应用效果进行研究，并进入试验阶段，2016年正式使用。本文数据统计时间为2014年3月至2017年6月，共7个学期，涉及11个班级。利用模拟痰标本进行抗酸染色实验教学后，结核分枝杆菌阳性检出率远远高于以往使用真正的痰标本的阳性检出率，具体见表2。