二甲双胍对ALDH+胃癌干细胞的抑制作用及其机制

王一，向勇平，刘丹丹，刘理金，姜伟，李锦毅

肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)是存在于肿瘤中的一小群特质细胞[1]，既有类似干细胞的自我更新、增殖、分化特性，同时有强致瘤能力[2-3]。1997年Bonnet等[4]首次在急性髓性白血病中发现CSC，随后实体瘤乳腺癌、神经系统肿瘤、结肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等中也陆续发现了CSC[5]。乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)是一种催化细胞内乙醛氧化为乙酸、催化视黄醇氧化为视黄酸的细胞溶质酶。研究发现，高表达ALDH1是CSC及正常干细胞的共同特征[6-7]。二甲双胍(metformin，Met)是治疗2型糖尿病的传统口服药物，研究发现其可影响肿瘤细胞的代谢及上皮间质转化，具有抗肿瘤作用[8-10]。本研究通过ALDH标志物分选胃癌干细胞，并进一步探讨Met对CSC的抑制作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和设备 细胞系MKN45由中国协和医科大学细胞中心提供。实验动物为BALB/c-nu小鼠，雌性，4周龄，购自中国医学科学院实验动物研究所。主要试剂：RPMI 1640、DMEM/F12培养基、无血清添加剂N2、B27购自美国Gibco公司，重组人表皮细胞生长因子(recombinant human epidermal growth factor，EGF)、重组人碱性成纤维生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，bFGF)购自美国PeproTech公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，胰酶、四甲基偶氮唑盐(methabenzthiazuron，MTT)、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)购自美国Amresco公司，青霉素、链霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司，结晶紫购自上海碧云天生物技术有限公司，ALDEFLUOR®干细胞鉴定试剂盒购自加拿大Stem Cell公司。普通和倒置光学显微镜购自日本Nikon公司，酶联免疫检测仪购自美国BioRad公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 ALDH+CSC细胞鉴定

1.2.1.1 细胞培养及ALDH+细胞分选 将人胃癌细胞系MKN45用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5%CO2培养箱内培养，0.25%胰酶消化后传代。选取对数生长期细胞，制备浓度为1×106个/ml的单细胞悬液。标记一个实验管和一个对照管

实验管：在细胞中加入活化的ALDEFLUOR®试剂5μl/ml，由于ALDH能将氟硼二吡咯氨基乙醛(BAAA)转化为绿色发光物氟硼二吡咯甘氨酸(BAA)，所以通过专用通道分选带绿色荧光BAA的细胞，即为ALDH+细胞[11]。

对照管：作为阴性对照组。加入十二烷基三乙基溴化铵(DEAB) 5μl/ml，由于特殊抑制剂DEAB能抑制ALDH的作用，所以可抑制BAAA转化为BAA，故分选出ALDH–细胞。反应30min后，250×g离心5min，弃上清，用ALDEFLUOR®缓冲液重悬，用流式细胞仪检测，检测前加入碘化丙啶(PI)染色标记死亡细胞。

1.2.1.2 自我更新能力实验 分选得到的ALDH+和ALDH–细胞分别用PBS清洗2次，悬浮于CSC培养基，调整细胞浓度为5000个/ml，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。分别于1、2、3、4、5、6、7、8d(以24h作为1d)时采用MTT法检测细胞在570nm处的光密度(OD)值，并绘制生长曲线。

1.2.1.3 分化能力实验 将MKN45亲本细胞及分选所得ALDH+细胞和ALDH–细胞以5×104个/ml接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。1周后用流式细胞仪检测MKN45亲本细胞、ALDH+细胞和ALDH–细胞中ALDH+细胞所占比例。

1.2.1.4 致瘤实验 将ALDH+和ALDH–细胞悬浮于PBS与基质胶(1:1)混合液中，分为ALDH+细胞组和ALDH–细胞组，每组接种5×104个细胞于BALB/c-nu小鼠皮下，每组接种6只小鼠，观察出瘤情况，测量瘤体长短径，记录瘤体出现的和间及个数。瘤体体积=1/2长径×短径×短径。

1.2.2 Met对ALDH+细胞生长及相关基因表达的抑制作用

1.2.2.1 ALDH+细胞生长抑制实验 收集对数生长期的MKN45亲本细胞进行计数，以1×106个细胞接种于培养皿，用含10% FBS的RPMI 1640培养基悬浮细胞。将加入终浓度分别为1、5mmol/L Met的细胞组作为1mmol/L Met组、5mmol/L Met组，以不加药物的细胞为对照组(命名为MKN45细胞组)，各组处理48h后，流式细胞仪检测ALDH+细胞比例。

1.2.2.2 RT-PCR检测干性相关基因Oct4、Sox2和AKT的表达 采用Trizol法提取1.2.2.1所述对照组和实验组细胞总RNA，取1μg RNA反转录为cDNA，以cDNA产物为模板，分别加入Oct4、Sox2、AKT上下游引物，以GAPDH作为内部参照。Oct4上游引物：5'-AGCGAACCAGTATCGAGAAC-3'，下游引物：5'-TTACAGAACCACACTCGGAC-3'；Sox2上游引物：5'-ACACCAATCCCATCCACACT-3'，下游引物：5'-GCAAACTTCCTGCAAAGCTC-3'；AKT上游引物：5'-TCTATGGCGCTGAGATTGTG-3'，下游引物：5'-CTTAATGTGCCCGTCCTTGT-3'；GAPDH上游引物：5'-CCGTCTAGAAAAACCTGCC-5'，下游引物：5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-5'。反应体系含上下游引物各0.4μl，模板cDNA 1μl，ROX对照染料0.4μl，SYBR Premix ExTaq10μl，DEPC水7.8μl，共20μl。95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。利用StepOne软件进行数据分析，每个标本重复3次，取平均值为Ct值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，计数资料以百分率表示。两组计量资料满足正态、方差齐性的基础上，采用t进行比较，多组间比较采用方差分析；计数资料的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ALDH+CSC的鉴定和验证

2.1.1 自我更新能力 如图1所示，培养分选后的ALDH+和ALDH–细胞均持续生长，3d后ALDH+组细胞生长速度快于ALDH–组细胞(P＜0.05)。

2.1.2 ALDH+细胞的分化能力 由图2可见，MKN45亲本细胞及其分选出的ALDH+和ALDH–细胞培养1周后，ALDH+的表达率分别为33.8%、37.7%和7.3%。

图1 ALDH+细胞及ALDH–细胞的生长曲线Fig. 1 Survival curves of ALDH+ and ALDH– cells

图2 MKN45亲本细胞及ALDH+、ALDH–细胞培养1周后ALDH+细胞的比例Fig. 2 Proportion of ALDH+ cell in MKN45 cells, ALDH+ cells and ALDH– cells 7 days after cultivation in vitro

2.1.3 ALDH+细胞的致瘤能力 由图3可见，ALDH+细胞接种小鼠在第10天出现瘤体，至实验结束致瘤率为66.7%；ALDH–细胞接种小鼠在第12天出现瘤体，至实验结束时致瘤率为50%(图3)。ALDH+细胞接种小鼠的肿瘤体积39.8±33.9mm3，与ALDH–细胞组细胞(12.5±18.5m3)相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

图3 实验结束时ALDH+细胞组、ALDH–细胞组移植瘤瘤体比较Fig. 3 The size of transplanted tumors in ALDH+ cell group and ALDH– cell group at the end of the experiment

2.2 Met对ALDH+细胞生长的抑制作用 由图4可见，流式细胞仪检测MKN45细胞组、1mmol/L Met组、5mmol/L Met组中ALDH+细胞比例分别为29.9%、17.0%、8.7%。重复试验12次检测后，MKN45细胞组、1mmol/L Met组、5mmol/L Met组ALDH+细胞比例分别为36.5%±5.4%、15.6%±1.9%和7.6±1.6%，三组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 Met对Oct4、Sox2和AKT基因表达的影响

2.3.1 Met对干性相关基因Oct4、Sox2 mRNA表达的影响 RT-PCR结果显示，Oct4 mRNA在1mmol/L Met组表达高于MKN45细胞组，5mmol/L Met组表达低于MKN45细胞组，差异有统计学意义(P＜0.05)。与MKN45细胞组相比，Sox2 mRNA在两个Met处理组表达均下降，且随Met浓度升高下降更为明显，差异有统计学意义(P＜0.05，图5A、B)。

2.3.2 Met对AKT mRNA表达的影响 由图5C可见，与MKN45细胞组相比，AKT mRNA在两个Met处理组中均表达下降，且随Met浓度升高下降更为明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图4 三组ALDH+细胞比例比较Fig. 4 The proportion of ALDH+ cells in the 3 groups of cells

图5 三组Oct4、Sox2和AKT mRNA的表达Fig. 5 Expressions of Oct4, Sox2 and AKT mRNA in the 3 groups of cells

3 讨 论

CSC的分选鉴定是CSC研究中的关键问题。CSC的鉴定一般基于特殊标志物，如膜蛋白或细胞酶[12]、侧群细胞(SP细胞)[13]或CD133[14]等具有干细胞特性的分子标志物。ALDH是存在于细胞内的一种依赖NADP的氧化酶，在干细胞的自我保护、分化与增殖方面具有重要作用，是正常干细胞与CSC的主要标志物[15]。在实体瘤中，ALDH可作为CSC的标志物[16]。

本研究对ALDH的生物学特性进行分析显示，ALDH+细胞的生长速度快于ALDH–细胞，ALDH+和ALDH–细胞培养1周后，ALDH+细胞中分化出ALDH–细胞，分裂后的细胞中ALDH+表达比例接近MKN45亲本细胞，该结果说明ALDH+细胞可诱导分化出ALDH–细胞。而ALDH–细胞在培养后也出现了小部分的ALDH+细胞，这是由于具有完整细胞膜的细胞才含有ALDH反应产物，所以ALDEFLUOR®干细胞鉴定试剂不能对死细胞或没有完整细胞膜的衰老细胞进行鉴定。因此考虑是由于细胞的不均一性、培养条件的不均一性或处于不同细胞周期等因素导致ALDH–细胞培养后中有ALDH+细胞的出现。

致瘤实验是验证CSC的金标准[17]。本研究裸鼠成瘤实验显示，ALDH+细胞致瘤率高、出瘤早、瘤体大、生长速度快。以上结果从自我更新能力、分化能力和致瘤能力方面证实了胃癌ALDH+细胞具有CSC特性，表明ALDH+细胞可作为靶细胞用于胃癌的治疗研究。

有报道证实，在乳腺癌、胰腺癌和恶性胶质瘤中Met可抑制其CSC的生长[18-19]，且Met可抑制卵巢癌CSC-ALDH+细胞的生长和增殖[20]。本实验研究了Met对ALDH+胃癌CSC的影响，结果显示，与对照组相比，不同浓度Met均可降低胃癌细胞MKN45中ALDH+细胞的比例，且随着二甲双胍浓度的升高，ALDH+细胞的比例明显下降，表明Met对CSC具有抑制作用。

本实验还进一步探索了Met对干性相关基因Oct4和Sox2表达的影响。RT-PCR结果显示，不同浓度的Met作用后，胃癌细胞系中Oct4和Sox2表达量均有变化。Oct4基因在1mmol/L Met作用后出现轻度上调，5mmol/L Met作用后表达明显下降。Sox2基因在1mmol/L、5mmol/L Met作用后均表现为下调，且随二甲双胍浓度升高表达量逐渐下降。Oct4和Sox2基因表达量下降与干细胞量下降有关，此结果与Met抑制ALDH+细胞生长相一致。AKT是PI3K/AKT信号通路相关基因，PI3K/AKT信号通路与细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤发生相关[21-22]，AKT过表达与肿瘤组织耐受化疗有关[23]。有报道指出，Met可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制ALDH+胰腺癌CSC[24]。本实验结果显示，Met作用后AKT基因表达量下降。由于前期实验已证实Met可抑制ALDH+细胞的增殖，且ALDH+细胞具有干细胞特性，因此推测Met也是通过抑制AKT基因的表达，从而降低ALDH+胃癌干细胞的耐药性，使ALDH+细胞的增殖受到抑制，进而发挥抑制胃癌干细胞的作用。当然，该推测还有待进一步研究证实。

综上所述，Met可抑制胃癌细胞系中ALDH+细胞生长，即可抑制胃癌CSC的生长，其作用机制推测与Met抑制PI3K/AKT信号通路有关。同时Met也可为临床治疗胃癌提供选择参考。

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