山杏体细胞胚胎发生及其组织学观察

何炎红，吴高殷，白玉娥，田 春

（1.内蒙古农业大学 林学院，内蒙古 呼和浩特 010020；2.内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010010）

山杏Armeniaca sibirica是内蒙古干旱、半干旱地区沙地及山地主要的乡土树种，具有较大的实用价值，包括食用价值、园林绿化和医药价值等[1]，其产业发展在本地区生态建设和经济建设中具有重要意义。而山杏的常规繁殖为播种和嫁接[2]，繁殖速率慢、周期长。近些年，随着生物技术的发展及其在林业上的应用，一些针叶阔叶树种通过非常规繁育方法获得了完整的再生植株，例如植物组织培养、体细胞胚胎发生和人工种子等。体细胞胚胎发生通过胚性愈伤组织的诱导、增殖和分化成熟后可得到数量多、大小一致的胚状体。关于林木的体细胞胚胎发生研究也取得了一些成果，例如马尾松、云杉和文冠果[3-6]。本文中研究了山杏茎尖体细胞胚胎发生发育的过程，并对影响山杏胚性愈伤组织诱导的因素进行探讨，旨在建立山杏体细胞胚胎发生体系，为后期的人工种子的制作、新品种遗传改良、种资创新和缩短育苗周期提供技术和理论材料。

1 材料与方法

1.1 茎尖愈伤组织的诱导

以内蒙古呼和浩特市内蒙古良木繁育基地山杏种植区的山杏茎尖作为外植体。茎尖清洗消毒后，剥取约2 mm茎尖，并转移到培养基。以MS为基本培养基，附加6-BA（0.5、1.0 mg/L），NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L） 和 2,4-D（0.1、0.2、0.5 mg/L）。在(25±2) ℃、暗光下进行培养。每隔7 d观察愈伤组织的诱导及生长情况。

1.2 茎尖胚性愈伤的继代与增殖

筛选出胚性愈伤组织进行增殖培养，每组培养基中添加6-BA（0.5 mg/L）和2,4-D（0.2 mg/L），然后分别添加0.5 g/L水解乳蛋白，0.5 g/L水解酪蛋白和0.5 g/L肌醇3种附加物。在(25±2)℃、暗光下进行培养。每隔7 d观察愈伤组织的增殖率及生长情况。

1.3 茎尖胚性愈伤组织的细胞结构观察

材料取自茎尖诱导出的愈伤组织，从诱导期直至胚性愈伤分化，每隔7 d定期取样。将愈伤组织样品放入FAA固定液中固定24 h以上，采用石蜡法制作切片，用Leica光学显微镜观察切片。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对山杏茎尖愈伤组织诱导的影响

剥取的茎尖在6-BA与NAA和6-BA与2,4-D的处理组合下诱导愈伤组织，其愈伤组织诱导率及生长情况见表1。6-BA与2,4-D的组合中，随着分裂素增加，愈伤组织分裂速率加快，且愈伤组织的数量较多，6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L组合时，诱导率高达88.0%，四周愈伤呈白色颗粒状，但生长后期褐化严重，需要及时更换培养基进行继代增殖培养；当6-BA质量浓度为1.0 mg/L时，增加NAA质量浓度，愈伤组织诱导率呈下降趋势；当6-BA质量浓度为0.5 mg/L、NAA质量浓度为0.2 mg/L时，茎尖愈伤组织诱导率高达100%，愈伤组织的数量较多呈白色透明小颗粒（见图1）。所以选取MS+6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）为最佳茎尖愈伤组织诱导培养基。

表1 不同激素配比对茎尖愈伤组织诱导的影响Table1 Effects of different hormone combinations on callus induction from stem tips

图1 茎尖愈伤组织的诱导Fig.1 Callus induction from stem tips

2.2 不同附加物对山杏胚性愈伤组织增殖的影响

不同附加物对山杏胚性愈伤组织增殖的影响见表2。由表2可知，附加物水解乳蛋白、水解酪蛋白和肌醇处理的愈伤增殖率均超过80%，在添加水解酪蛋白的培养基中增殖率最高，达92.2%，且愈伤增殖量也较多，随着培养时间增加，在外植体自身代谢产物和培养基不断减少的因素制约下，部分愈伤组织不增殖或者褐化死亡（见图2）。对增殖率进行方差分析，结果见表3。由表3可看出，不同附加物对愈伤组织增殖的影响间差异不显著。

2.3 山杏体细胞胚胎发生形态学观察

在对山杏茎尖胚性愈伤组织进行增殖和分化诱导期间，定期取样，放进FAA固定液中固定24 h，进行石蜡切片观察（见图3）。由图3可以看出，在山杏体细胞胚胎发生过程中能明显看出球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚等阶段。

表2 不同附加物对胚性愈伤组织增殖的影响Table2 Effects of different additives on embryonic callus proliferation

图2 胚性愈伤组织的增殖Fig.2 Embryonic callus proliferation

表3 不同附加物对胚性愈伤组织增殖影响的方差分析†Table3 Variance analysis of effects of different additives on embryonic callus proliferation

图3 山杏体细胞胚胎发生组织学观察Fig.3 Histological observation of somatic embryogenesis processes in A. sibirica

3 结论与讨论

在激素6-BA质量浓度为0.5 mg/L、NAA质量浓度为0.2 mg/L时，山杏茎尖愈伤组织诱导率高达100%，从中筛选胚性愈伤组织进行增殖培养。在胚性愈伤组织增殖培养基中添加附加物水解乳蛋白、水解酪蛋白和肌醇，添加水解酪蛋白处理的愈伤增殖率最高，为92.2%。在山杏体细胞胚胎发生过程中能明显看出球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚等阶段。其体细胞胚胎发生机理还需在分子水平深入探讨。

在山杏组织培养过程中，以6-BA和IBA为激素组合的研究报道较为常见，且在愈伤组织诱导初期6-BA的适宜浓度相对较高[7]，这一论点与本文的结果一致。本研究中，在山杏茎尖胚性愈伤诱导和增殖过程中均添加了激素2,4-D，在胚性愈伤组织分化的过程中，愈伤分化率极低且分化苗长势较弱[8-10]，这与朱华国等[11]对棉花体细胞胚胎发生的研究结果基本一致，即2,4-D能够使细胞快速完成脱分化过程，使得愈伤快速增殖并产生大量细胞质丰富的细胞，但同时由于其效应过强，仅有少量前胚性细胞团能够从大量的细胞质丰富的细胞转化过来，限制了前胚性细胞团的产生，从而进一步限制了胚性愈伤向体细胞胚的转化，出现了细胞质丰富的细胞多但分化率低的现象。Aung Htay Naing等[12]在对Chrysanthemum cv. Euro体细胞胚的研究中指出在同时使用细胞分裂素（BA、TDZ和KN）和2,4-D的情况下可以诱导体细胞胚发生，但仅使用2,4-D时体细胞胚不发生。研究认为体细胞胚不发生与前期培养中长期使用2,4-D有关[8-9]，因此为了促进胚性愈伤组织发生，在培养中应降低2,4-D浓度或者不使用2,4-D。

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